Hücre Hücre İskeletinin Model Sistemi Olarak (Poro-)Elastik Kasılma Aktomyosin Ağlarının Mekaniği
Summary
Bu çalışmada, kontrollü koşullar altında aktomiyosin jellerinin poroelastisitesini incelemek için in vitro rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmıştır. Aktomiyosin jelinin ve gömülü çözücünün dinamikleri, ağ poroelastisitesinin gösterildiği şekilde ölçülür. Ayrıca deneysel zorlukları, ortak tuzakları ve hücre hücre iskeleti mekaniği ile olan ilgisini tartışıyoruz.
Abstract
Hücreler şekillerini aktif olarak değiştirebilir ve iç yapılarını aktif olarak yeniden düzenleme yeteneklerine bağlı bir özellik olan hareketli hale gelebilir. Bu özellik, hücre hücre iskeletinin mekanik ve dinamik özelliklerine, özellikle de polar aktin filamentlerinin, miyozin motorlarının ve içsel kasılma özellikleri sergileyen aksesuar proteinlerin aktif bir jeli olan aktomiyozin hücre iskeletine atfedilir. Genellikle kabul edilen görüş, hücre iskeletinin viskoelastik bir malzeme gibi davranmasıdır. Bununla birlikte, bu model, hücre iskeletini poroelastik bir aktif materyal olarak tanımlayan bir resimle daha tutarlı olan deneysel sonuçları her zaman açıklayamaz – sitosol ile gömülü elastik bir ağ. Miyozin motorları tarafından üretilen kontraktilite gradyanları, sitosolün jel gözenekleri boyunca akışını yönlendirir, bu da sitoiskeletin ve sitosolün mekaniğinin sıkıca bağlandığı sonucuna varır. Poroelastisitenin ana özelliklerinden biri, jel elastik modülüne, gözenekliliğine ve sitosol (çözücü) viskozitesine bağlı etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilen, ağdaki streslerin difüzif gevşemesidir. Hücrelerin yapılarını ve malzeme özelliklerini düzenlemenin birçok yolu olduğu için, sitoiskelet mekaniğinin ve sitosol akış dinamiklerinin nasıl birleştiğine dair mevcut anlayışımız tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, poroelastik aktomiyosin jellerinin materyal özelliklerini hücre hücre iskeleti için bir model sistem olarak karakterize etmek için in vitro bir rekonstrüksiyon yaklaşımı kullanılmaktadır. Jel büzülmesi, nüfuz eden çözücünün akışının ortaya çıkmasına neden olan miyozin motor kontraktilitesi tarafından tahrik edilir. Makale, bu jellerin nasıl hazırlanacağını ve deneylerin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Ayrıca, solvent akışının ve jel büzülmesinin hem yerel hem de küresel ölçekte nasıl ölçüleceğini ve analiz edileceğini tartışıyoruz. Veri nicelleştirme için kullanılan çeşitli ölçekleme ilişkileri verilmiştir. Son olarak, deneysel zorluklar ve ortak tuzaklar, hücre hücre iskeleti mekaniği ile ilgileri de dahil olmak üzere tartışılmaktadır.
Introduction
Canlı hücreler benzersiz mekanik özelliklere sahiptir. Uygulanan kuvvetlere pasif olarak tepki verme yeteneğinin yanı sıra, dış uyaranlara yanıt olarak aktif olarak kuvvet üretme yeteneğine de sahiptirler1. Özellikle hücre hareketliliği sırasında çeşitli hücresel süreçler için gerekli olan bu özellikler, öncelikle hücre hücre iskeletinin, özellikle polar aktin filamentlerinin, miyozin moleküler motorlarının ve aksesuar proteinlerinin aktif bir jeli olan aktomiyozin sitoiskeletinin mekanik ve dinamik özelliklerine atfedilir. Bu aktomiyosin ağları, aktin filamentlerini çapraz bağlayan ve ATP hidrolizi2 tarafından beslenen ağda aktif olarak mekanik stresler üreten miyozin motor proteinleri tarafından tahrik edilen içsel öz-organizasyon ve büzülme özellikleri sergiler.
Hücre iskeletinin malzeme özelliklerini incelemek için çok sayıda deneysel ve teorik çalışma yapılmıştır3. Yaygın olarak kabul edilen görüş, hücre iskeletinin viskoelastik bir materyal gibi davrandığı yönündedir4. Bu, kısa zaman ölçeklerinde, hücre iskeletinin elastik bir malzeme gibi davrandığı ve uzun zaman ölçeklerinde, çapraz bağlama proteinleri ve miyozin motor dekolmanı (ve yeniden bağlanması) nedeniyle viskoz bir sıvı gibi davrandığı anlamına gelir. ağın dinamik olarak dönmesini sağlar. Bununla birlikte, birçok durumda, viskoelastik model, hücre iskeletini ve daha genel olarak, poroelastik aktif madde 5,6 olarak tanımlanan hücre sitoplazmasını tanımlayan bir resimle daha tutarlı olan deneysel sonuçları tanımlayamaz. Bu tür malzemeleri karakterize eden iki ana özellik vardır. (i) İlk ana özellik, hücre kanaması7, motilitesi8 ve hücre şekli salınımları9 gibi işlemlerin altında yatan miyozin motorları tarafından tahrik edilen kontraktilite gradyanları tarafından jel gözenekleri boyunca nüfuz eden sitosol (“çözücü”) akışının oluşturulmasıdır. Bu tür sitozolik akışların ortaya çıkışı, hücre hareketliliğinde olduğu gibi lokal, blebbing için veya küresel olabilir. İkinci durumda, hücre arkasındaki kontraktil uygulanan gerilmeler, sitozolik sıvının akışını hücre önüne doğru yönlendirir ve bu da lamellipodia montajı8 için gerekli protein havuzunu doldurur. (ii) İkinci ana özellik, gerilmelerin gevşemesinin difüzif olması ve jel elastik modülüne, jel gözenekliliğine ve çözücü viskozitesine bağlı olan etkili bir difüzyon sabiti ile karakterize edilmesidir5. Poroelastik difüzyon sabiti, sistemin uygulanan bir gerilime ne kadar hızlı tepki verdiğini belirler. Daha yüksek difüzyon sabitleri, daha hızlı gerilim yeniden dağılımına karşılık gelir. Bu da, hücre içi sitozolik sıvının, miyozin motorları tarafından üretilen aktif kontraktil stresler gibi harici veya dahili olsun, uygulanan mekanik stresi takiben hücre içinde yeniden dağıtılmasının ne kadar süreceğini belirler. Bu nedenle, bu örnekler, sitoiskeletin ve sitosolün mekaniğinin sıkıca bağlandığını ve ayrı ayrı tedavi edilemeyeceğini göstermektedir3.
Hücreler mekanik özelliklerini çeşitli şekillerde düzenleyebildiklerinden, ağ mekaniği ve akışkan akış dinamikleri arasındaki etkileşim tam olarak anlaşılamamıştır. Güçlü bir alternatif yaklaşım, çeşitli mikroskobik bileşenlerin ve sistem parametrelerinin tam kontrolüne izin veren in vitro yeniden yapılandırılmış sistemlerin kullanılmasıdır ve bu da bu model sistemleri fiziksel analiz için en uygun hale getirir10,11. Bu yaklaşım, protein bileşiminin ve sistem geometrisinin aktin bazlı motilitesi 12,13,14,15,16,17,18, aktomiyosin ağlarının 2D modellemesi 19,20,21,22 üzerindeki etkisini incelemek için başarıyla kullanılmıştır ve bu makalenin odak noktası olan poroelastik aktomiyosin jellerinin ağ kontraktilitesi ve akışkan akış dinamikleri arasındaki etkileşim23.
Bu yazıda, kontrol edilebilir boyutlara ve malzeme özelliklerine sahip kontraktil elastik aktomiyosin ağlarının hazırlanması, Ideses ve ark.23’ün çalışmalarına dayanarak tartışılmıştır. Sözleşme jelinin ve boşaltılmış çözücünün dinamikleri analiz edilir ve ölçülür, bu sayede bu aktomiyosin jellerinin poroelastik bir aktif madde olarak tanımlanabileceği gösterilmiştir. Solvent viskozitesinin stres difüzyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi, bu ağların poroelastik doğasını daha da doğrulamaktadır. Veri nicelleştirme için kullanılan çeşitli ölçeklendirme ilişkileri sağlanır. Son olarak, deneysel zorluklar, ortak tuzaklar ve deneysel sonuçların hücre hücre iskeleti ile ilgisi de tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, poroelastik aktomiyosin jellerinin mekaniğini, hücre sitoiskeletinin ve daha genel olarak, poroelastik bir materyal olarak davrandığı gösterilen hücre sitoplazmasının model bir sistemi olarak karakterize etmek için in vitro bir yaklaşım kullanılmaktadır 3,5. Hücre sitoiskeletinin (sitoplazma) reolojisi, uygulanan mekanik stresi takiben hücre içi sitozolik sıvının hücre içinde yeniden dağılmasının ne kadar süreceğini be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dina Aranovich’e protein saflaştırma ve etiketleme için teşekkür ederiz. G.L., Jabotinsky Doktora Bursu için İsrail Bilim, Teknoloji ve Uzay Bakanlığı’na minnettardır. A.B.G., İsrail Bilim Vakfı’na (hibe 2101/20) ve İsrail Devleti Bilim ve Teknoloji Bakanlığı’na (hibe 3-17491) mali destek için minnettardır.
Materials
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
- Alberts, B., et al. . Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , (2002).
- Howard, J. . Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , (2001).
- Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
- Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
- Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
- Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
- Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
- Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
- Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
- Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -. F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
- Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
- Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).
- Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).
- Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413 (2019).
- Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
- Pontani, L. -. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
- Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
- Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).
- Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
- Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
- Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).
- Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
- Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
- Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, 55-71 (1982).
- Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
- Cheng, N. -. S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
- Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).
- MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).
- Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
- Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).
