Zebrafisk dyremodel til undersøgelse af allergiske reaktioner som reaktion på flåtspytbiomolekyler

Summary

Her bruges zebrafisk (Danio rerio) som model til at studere allergiske reaktioner og immunresponser relateret til alfa-Gal syndrom (AGS) ved at evaluere allergiske reaktioner på flåtspyt og pattedyrs kødforbrug.

Abstract

Flåter er leddyrvektorer, der forårsager sygdom ved patogenoverførsel, og hvis bid kan være relateret til allergiske reaktioner, der påvirker menneskers sundhed over hele verden. Hos nogle individer er høje niveauer af immunglobulin E-antistoffer mod glycanen Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) blevet induceret af flåtbid. Anafylaktiske reaktioner medieret af glycoproteiner og glycolipider indeholdende glycan α-Gal, der er til stede i flåtspyt, er relateret til alfa-Gal syndrom (AGS) eller pattedyrs kødallergi. Zebrafisk (Danio rerio) er blevet en meget anvendt hvirveldyrmodel til undersøgelse af forskellige patologier. I denne undersøgelse blev zebrafisk brugt som model for undersøgelsen af allergiske reaktioner som reaktion på α-Gal og pattedyrs kødforbrug, fordi de ligesom mennesker ikke syntetiserer denne glykan. Til dette formål blev adfærdsmønstre og hæmoragiske anafylaktiske allergiske reaktioner som reaktion på Ixodes ricinus tick spyt og pattedyrs kødforbrug evalueret. Denne eksperimentelle tilgang gør det muligt at indhente gyldige data, der understøtter zebrafiskens dyremodel til undersøgelse af flåtbårne allergier, herunder AGS.

Introduction

Flåter er vektorer af patogener, der forårsager sygdomme og er også årsagen til allergiske reaktioner, der påvirker menneskers og dyrs sundhed over hele verden ^1,2. Under flåtfodring letter biomolekyler i krydsspyt, især proteiner og lipider, fodring af disse ektoparasitter og undgår værtsforsvar³. Nogle spytbiomolekyler med glycan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modifikationer fører til produktion af høje anti-α-Gal IgE-antistofniveauer efter flåtbiddet, kun hos nogle individer, som er kendt som α-Gal syndrom (AGS)⁴. Dette er en sygdom forbundet med IgE-medieret allergi, der kan resultere i anafylaksi til flåtbid, ikke-primatpattedyrs kødforbrug og nogle lægemidler såsom cetuximab⁵. Reaktioner på α-Gal er ofte alvorlige og kan undertiden være dødelige 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

α-Gal findes i alle pattedyr undtagen aber, aber og mennesker fra den gamle verden, der ikke har evnen til at syntetisere α-Gal¹³. Imidlertid udtrykker patogener som bakterier og protozoer denne glycan på deres overflade, hvilket kan fremkalde produktion af store mængder anti-α-Gal IgM / IgG-antistoffer og kan være en beskyttelsesmekanisme mod disse patogener^16,17. Imidlertid øger produktionen af anti-α-Gal-antistoffer risikoen for at udvikle IgE-medierede anti-α-Gal-allergier ^7,13. Naturlige anti-α-Gal-antistoffer produceret hos mennesker, hovedsageligt af IgM/IgG-undertyperne, kunne være forbundet med denne modifikation, der findes i bakterier fra tarmmikrobiota¹⁶. AGS kan være en udfordrende klinisk diagnose, da den vigtigste diagnostiske metode i øjeblikket er baseret på en klinisk historie med forsinkede allergiske reaktioner, især forbundet med fødevareallergier (dvs. kløe, lokaliserede nældefeber eller tilbagevendende angioødem til anafylaksi, urticaria og gastrointestinale symptomer) og måling af IgE-anti-α-Gal-antistofniveauer⁹. Aktuelle resultater tyder på, at flåtbid udgør en af de største risici ved forekomsten af AGS 18,19, en 20 gange eller større stigning i IgE-niveauer til α-Gal efter et flåtbid 19, en historie med flåtbid hos patienter med AGS^20,21,22, eksistensen af antistoffer, der er reaktive over for flåtantigener hos AGS-patienter ^19, og at anti-α-Gal IgE er stærkt relateret til anti-tick IgE-niveauer^19,23, men yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere, hvilke biomolekyler der faktisk er involveret.

Derudover er et andet muligt scenario patienter, der udviser stærke allergiske reaktioner på flåtbid og høje niveauer af anti-α-Gal IgE-antistoffer, men er tolerante over for pattedyrs kødforbrug¹². Derfor kan pattedyrs kødallergi være en særlig type flåtbidrelateret allergi. De vigtigste flåtarter, der er forbundet med AGS, omfatter Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasilien), Amblyomma testudinarium og Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus (Australien) og Ixodes ricinus (den vigtigste vektor for borreliose i Europa)^11,24.

Den eneste model, der er blevet brugt til at evaluere IgE-produktion relateret til flåtbid, er musemodellen genetisk modificeret med genet for α-1,3-galactosyltransferase slået ud (α-Gal KO) mus^25,26, fordi mus ligesom andre pattedyr også udtrykker α-Gal på proteiner og lipider og ikke producerer IgE til α-Gal. Zebrafisk (Danio rerio) er imidlertid en nyttig model for biomedicinsk forskning anvendt på pattedyr, fordi den deler mange anatomiske ligheder med pattedyr og ligesom mennesker heller ikke er i stand til at syntetisere α-Gal. Da α-Gal ikke produceres naturligt i zebrafisk, er det en overkommelig model, let at manipulere og tillader en høj prøvestørrelse til undersøgelse af α-Gal-relaterede allergiske reaktioner.

I denne undersøgelse anvendes zebrafisk som modelorganisme til at karakterisere og beskrive lokale allergiske reaktioner, adfærdsmønstre og de molekylære mekanismer, der er forbundet med respons på perkutan sensibilisering over for flåtspyt^26,27 og efterfølgende kødforbrug hos pattedyr. Til dette formål udsættes fisk for flåtspyt ved intradermal injektion og fodres derefter med hundefoder, der indeholder kødafledte produkter fra pattedyr, der er egnede til dyrebrug, og som indeholder α-Gal²⁷, hvorefter mulige relaterede allergiske reaktioner vurderes. Denne metode kan anvendes til undersøgelse af andre biomolekyler relateret til allergiske processer, især dem, der er relateret til AGS.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af den etiske komité for dyreforsøg ved University of Castilla La Mancha under undersøgelsen “Evaluering af immunresponset på inaktiveret M. bovis vaccine og udfordring med M. marinum i zebrafiskens modelnummer PR-2017-05-12.” Flåter blev opnået fra laboratoriekolonien, hvor repræsentative prøver af flåter i kolonien blev testet af PCR for almindelige flåtpatogenerfor at bekræfte fraværet af patogener og vedligeholdt…

Representative Results

Protokollen, der præsenteres her, er baseret på flere aspekter af tidligere offentliggjorte eksperimenter27,30 og resultater udført i vores laboratorium, hvor zebrafiskmodellen er etableret og valideret til undersøgelse af AGS og immunresponset på α-Gal, fordi både mennesker og zebrafisk ikke syntetiserer dette molekyle13. Denne model tillader karakterisering og evaluering af en række allergiske reaktioner som følge af værtsrespo…

Discussion

Zebrafisk er en omkostningseffektiv og let håndterbar model, der også har været et meget gennemførligt værktøj til undersøgelse af molekylære mekanismer for immunrespons, patogensygdomme, test af nye lægemidler og vaccination og beskyttelse mod infektioner^33,34,35. Undersøgelsen af zebrafiskens adfærd er nyttig, da tidligere undersøgelser har vist, at nogle fiskearter forbliver ubevægelige i bunden af tanken, når d…

Materials

1.5 mL tube	VWR	525-0990
All Prep DNA/RNA	Qiagen	80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Disection set	VWR	631-1279
Dog Food – Red Classic	Acana
ELISA plates-96 well	Thermo Fisher Scientific	10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)	Dextra	NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix	Supermix	1708840
Microliter syringes	Hamilton	7638-01
Plate reader	any
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Pipette tip P10	VWR	613-0364
Pipette tip P1000	VWR	613-0359
Premium food tropical fish	DAPC
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
Stereomicroscope	any
Thermal Cycler Real-Time PCR	any
Tricaine methanesulphonate (MS-222)	Sigma	E10521