Sebrafisk dyremodell for studier av allergiske reaksjoner som respons på flåttspyttbiomolekyler

Summary

Her brukes sebrafisk (Danio rerio) som en modell for å studere allergiske reaksjoner og immunresponser relatert til alfa-Gal syndrom (AGS) ved å evaluere allergiske reaksjoner på spytt og pattedyrkjøttforbruk.

Abstract

Flått er leddyrvektorer som forårsaker sykdom ved patogenoverføring, og hvis bitt kan være relatert til allergiske reaksjoner som påvirker menneskers helse over hele verden. Hos noen individer har høye nivåer av immunoglobulin E-antistoffer mot glykanen Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) blitt indusert av flåttbitt. Anafylaktiske reaksjoner mediert av glykoproteiner og glykolipider som inneholder glykan-α-Gal, tilstede i kryssspytt, er relatert til alfa-Gal syndrom (AGS) eller pattedyrkjøttallergi. Sebrafisk (Danio rerio) har blitt en mye brukt virveldyrmodell for studier av ulike patologier. I denne studien ble sebrafisk brukt som en modell for studiet av allergiske reaksjoner som respons på α-Gal og pattedyrs kjøttforbruk fordi de, som mennesker, ikke syntetiserer dette glykanet. For dette formål ble atferdsmønstre og hemorragiske anafylaktiske allergiske reaksjoner som respons på Ixodes ricinus tick spytt og pattedyrs kjøttforbruk evaluert. Denne eksperimentelle tilnærmingen tillater obtention av gyldige data som støtter sebrafiskdyrmodellen for studier av flåttbårne allergier, inkludert AGS.

Introduction

Flått er vektorer av patogener som forårsaker sykdommer og er også årsaken til allergiske reaksjoner, som påvirker helsen til mennesker og dyr over hele verden ^1,2. Under flåttfôring letter biomolekyler i kryssspytt, spesielt proteiner og lipider, fôringen av disse ektoparasittene, og unngår vertsforsvar³. Noen spyttbiomolekyler med glykan-Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modifikasjoner fører til produksjon av høye anti-α-Gal IgE-antistoffnivåer etter flåttbitt, bare hos noen individer, som er kjent som α-Gal syndrom (AGS)⁴. Dette er en sykdom assosiert med IgE-mediert allergi som kan resultere i anafylaksi til flåttbitt, ikke-primat pattedyrkjøttforbruk og noen stoffer som cetuximab⁵. Reaksjoner på α-Gal er ofte alvorlige og noen ganger kan være dødelig 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

α-Gal finnes i alle pattedyr bortsett fra aper, aper og mennesker fra den gamle verden som ikke har evnen til å syntetisere α-Gal¹³. Imidlertid uttrykker patogener som bakterier og protozoer denne glykanen på overflaten, noe som kan indusere produksjon av høye mengder anti-α-Gal IgM / IgG-antistoffer og kan være en beskyttelsesmekanisme mot disse patogenene^16,17. Imidlertid øker produksjonen av anti-α-Gal-antistoffer risikoen for å utvikle IgE-medierte anti-α-Gal-allergier ^7,13. Naturlige anti-α-Gal-antistoffer produsert hos mennesker, hovedsakelig av IgM / IgG-subtypene, kan være assosiert med denne modifikasjonen som er tilstede i bakterier fra tarmmikrobiota¹⁶. AGS kan være en utfordrende klinisk diagnose, da den viktigste diagnostiske metoden for øyeblikket er basert på en klinisk historie med forsinkede allergiske reaksjoner, spesielt forbundet med matallergier (dvs. kløe, lokalisert elveblest eller tilbakevendende angioødem til anafylaksi, urtikaria, og gastrointestinale symptomer) og måling av IgE anti-α-Gal antistoff^{nivåer 9}. Nåværende funn tyder på at flåttbitt utgjør en av de viktigste risikoene ved utseendet til AGS 18,19, en 20 ganger eller større økning i IgE-nivåer til α-Gal etter et flåttbitt 19, en historie med flåttbitt hos pasienter med AGS^20,21,22, eksistensen av antistoffer reaktive mot kryssantigener hos AGS-pasienter ^19, og at anti-α-Gal IgE er sterkt relatert til anti-tick IgE-nivåer^19,23, men det er behov for ytterligere studier for å vurdere hvilke biomolekyler som faktisk er involvert.

I tillegg er et annet mulig scenario pasienter som presenterer sterke allergiske reaksjoner på flåttbitt og høye nivåer av anti-α-Gal IgE-antistoffer, men er tolerante mot pattedyrs kjøttforbruk¹². Derfor kan pattedyrkjøttallergi være en bestemt type flåttbittrelatert allergi. De viktigste flåttartene assosiert med AGS inkluderer Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium og Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus (Australia) og Ixodes ricinus (hovedvektoren av Lyme borreliosis i Europa)^11,24.

Den eneste modellen som har blitt brukt til å evaluere IgE-produksjon relatert til flåttbitt er musemodellen genetisk modifisert med genet for α-1,3-galaktosyltransferase slått ut (α-Gal KO) mus^25,26 fordi mus som andre pattedyr også uttrykker α-Gal på proteiner og lipider og ikke produserer IgE til α-Gal. Imidlertid er sebrafisk (Danio rerio) en nyttig modell for biomedisinsk forskning anvendt på pattedyr fordi den deler mange anatomiske likheter med pattedyr og, som mennesker, heller ikke er i stand til å syntetisere α-Gal. Siden α-Gal ikke produseres naturlig i sebrafisk, er det en rimelig modell, lett å manipulere, og tillater en høy prøvestørrelse for studiet av α-Gal-relaterte allergiske reaksjoner.

I denne studien brukes sebrafisk som en modellorganisme for å karakterisere og beskrive lokale allergiske reaksjoner, atferdsmønstre og molekylære mekanismer assosiert med respons på perkutan sensibilisering for kryssspytt^26,27 og påfølgende pattedyrkjøttforbruk. Til dette formål blir fisk utsatt for kryssspytt ved intradermal injeksjon og blir deretter matet med hundefôr, som inneholder pattedyrkjøttavledede produkter egnet for dyrebruk som inneholder α-Gal²⁷, og mulige relaterte allergiske reaksjoner vurderes. Denne metoden kan brukes til studier av andre biomolekyler relatert til allergiske prosesser, spesielt de som er relatert til AGS.

Protocol

Alle metodene beskrevet her er godkjent av den etiske komiteen for dyreforsøk ved Universitetet i Castilla La Mancha under studien “Evaluering av immunresponsen mot inaktivert M. bovis-vaksine og utfordring med M. marinum i sebrafiskmodellnummeret PR-2017-05-12.” Flått ble hentet fra laboratoriekolonien, hvor representative prøver av flått i kolonien ble testet ved PCR for vanlige krysspatogenerfor å bekrefte fraværet av patogener, og opprettholdt ved Institutt for para…

Representative Results

Protokollen som presenteres her er basert på flere aspekter av tidligere publiserte eksperimenter27,30 og resultater utført i vårt laboratorium hvor sebrafiskmodellen er etablert og validert for studiet av AGS og immunresponsen mot α-Gal fordi både mennesker og sebrafisk ikke syntetiserer dette molekylet13. Denne modellen tillater karakterisering og evaluering av en rekke allergiske reaksjoner som følge av vertsresponsen på kryssspy…

Discussion

Sebrafisk er en kostnadseffektiv og letthåndterlig modell som også har vært et svært gjennomførbart verktøy for studier av molekylære mekanismer for immunresponsen, patogensykdommer, ny legemiddeltesting og vaksinasjon og beskyttelse mot infeksjoner^33,34,35. Studien om oppførselen til sebrafisk er nyttig siden tidligere studier har funnet ut at noen fiskearter forblir ubevegelige i bunnen av tanken når de er stresset, n…

Materials

1.5 mL tube	VWR	525-0990
All Prep DNA/RNA	Qiagen	80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Disection set	VWR	631-1279
Dog Food – Red Classic	Acana
ELISA plates-96 well	Thermo Fisher Scientific	10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)	Dextra	NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix	Supermix	1708840
Microliter syringes	Hamilton	7638-01
Plate reader	any
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Pipette tip P10	VWR	613-0364
Pipette tip P1000	VWR	613-0359
Premium food tropical fish	DAPC
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
Stereomicroscope	any
Thermal Cycler Real-Time PCR	any
Tricaine methanesulphonate (MS-222)	Sigma	E10521