Zebrafisk djurmodell för studier av allergiska reaktioner som svar på fästingsalivbiomolekyler

Summary

Här används zebrafisk (Danio rerio) som modell för att studera allergiska reaktioner och immunsvar relaterade till alfa-Gal syndrom (AGS) genom att utvärdera allergiska reaktioner mot fästingsaliv och köttkonsumtion hos däggdjur.

Abstract

Fästingar är leddjursvektorer som orsakar sjukdom genom patogenöverföring och vars bett kan relateras till allergiska reaktioner som påverkar människors hälsa över hela världen. Hos vissa individer har höga nivåer av immunglobulin E-antikroppar mot glykanen Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) inducerats av fästingbett. Anafylaktiska reaktioner medierade av glykoproteiner och glykolipider innehållande glykanen α-Gal, närvarande i fästingsaliv, är relaterade till alfa-Gal syndrom (AGS) eller köttallergi hos däggdjur. Zebrafisk (Danio rerio) har blivit en allmänt använd ryggradsdjurmodell för studier av olika patologier. I denna studie användes zebrafisk som modell för studier av allergiska reaktioner som svar på α-Gal och däggdjursköttkonsumtion eftersom de, liksom människor, inte syntetiserar denna glykan. För detta ändamål utvärderades beteendemönster och hemorragiska anafylaktiska allergiska reaktioner som svar på Ixodes ricinus fästsaliv och köttkonsumtion hos däggdjur. Detta experimentella tillvägagångssätt möjliggör insamling av giltiga data som stöder zebrafiskdjurmodellen för studier av fästingburna allergier inklusive AGS.

Introduction

Fästingar är vektorer av patogener som orsakar sjukdomar och är också orsaken till allergiska reaktioner, som påverkar människors och djurs hälsa över hela världen ^1,2. Under fästingmatning underlättar biomolekyler i fästsaliv, särskilt proteiner och lipider, utfodringen av dessa ektoparasiter och undviker värdförsvar³. Vissa salivbiomolekyler med glykan Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modifieringar leder till produktion av höga anti-α-Gal IgE-antikroppsnivåer efter fästingbett, endast hos vissa individer, vilket är känt som α-Gal syndrom (AGS)⁴. Detta är en sjukdom associerad med IgE-medierad allergi som kan leda till anafylaxi mot fästingbett, icke-primat däggdjursköttkonsumtion och vissa läkemedel som cetuximab⁵. Reaktioner på α-Gal är ofta allvarliga och kan ibland vara dödliga 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

α-Gal finns i alla däggdjur utom Gamla världens apor, apor och människor som inte har förmågan att syntetisera α-Gal¹³. Patogener som bakterier och protozoer uttrycker emellertid denna glykan på deras yta, vilket kan inducera produktion av stora mängder anti-α-Gal IgM / IgG-antikroppar och kan vara en skyddsmekanism mot dessa patogener^16,17. Produktionen av anti-α-Gal-antikroppar ökar dock risken för att utveckla IgE-medierade anti-α-Gal-allergier ^7,13. Naturliga anti-α-Gal-antikroppar producerade hos människor, huvudsakligen av IgM / IgG-subtyperna, kan associeras med denna modifiering som finns i bakterier från tarmmikrobiota¹⁶. AGS kan vara en utmanande klinisk diagnos, eftersom den huvudsakliga diagnostiska metoden för närvarande är baserad på en klinisk historia av fördröjda allergiska reaktioner, särskilt förknippade med matallergier (dvs. klåda, lokaliserade nässelfeber eller återkommande angioödem mot anafylaxi, urtikaria och gastrointestinala symtom) och mätning av IgE-anti-α-Gal-antikroppsnivåer⁹. Aktuella fynd tyder på att fästingbett utgör en av de viktigaste riskerna vid uppkomsten av AGS 18,19, en 20-faldig eller större ökning av IgE-nivåerna till α-Gal efter en fästingbett 19, en historia av fästingbett hos patienter med AGS^20,21,22, förekomsten av antikroppar reaktiva mot fästingantigener hos AGS-patienter ^19, och att anti-α-Gal IgE är starkt relaterade till anti-tick IgE-nivåer^19,23 men ytterligare studier behövs för att bedöma vilka biomolekyler som faktiskt är involverade.

Dessutom är ett annat möjligt scenario patienter som uppvisar starka allergiska reaktioner mot fästingbett och höga nivåer av anti-α-Gal IgE-antikroppar men är toleranta mot köttkonsumtion^{hos däggdjur 12}. Därför kan köttallergi hos däggdjur vara en särskild typ av fästingbettrelaterad allergi. De viktigaste fästingarterna som förknippas med AGS är Amblyomma americanum (USA), Amblyomma sculptum (Brasilien), Amblyomma testudinarium och Haemaphysalis longicornis (Japan), Ixodes holocyclus (Australien) och Ixodes ricinus (huvudvektorn för borrelia i Europa)^11,24.

Den enda modellen som har använts för att utvärdera IgE-produktion relaterad till fästingbett är musmodellen genetiskt modifierad med genen för α-1,3-galaktosyltransferas utslagna (α-Gal KO) möss^25,26 eftersom möss liksom andra däggdjur också uttrycker α-Gal på proteiner och lipider och inte producerar IgE till α-Gal. Zebrafisk (Danio rerio) är dock en användbar modell för biomedicinsk forskning som tillämpas på däggdjur eftersom den delar många anatomiska likheter med däggdjur och, som människor, inte heller kan syntetisera α-Gal. Eftersom α-Gal inte produceras naturligt i zebrafisk är det en prisvärd modell, lätt att manipulera och möjliggör en hög provstorlek för studier av α-Gal-relaterade allergiska reaktioner.

I denna studie används zebrafisk som modellorganism för att karakterisera och beskriva lokala allergiska reaktioner, beteendemönster och de molekylära mekanismer som är förknippade med svar på perkutan sensibilisering av fästingsaliv^26,27 och efterföljande köttkonsumtion hos däggdjur. För detta ändamål exponeras fisk för fästingsaliv genom intradermal injektion och matas sedan med hundfoder, som innehåller köttprodukter från däggdjur som är lämpliga för djuranvändning och som innehåller α-Gal²⁷, därefter utvärderas eventuella relaterade allergiska reaktioner. Denna metod kan tillämpas på studier av andra biomolekyler relaterade till allergiska processer, särskilt de som är relaterade till AGS.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av etikkommittén för djurförsök vid universitetet i Castilla La Mancha under studien “Evaluation of the immune response to inactivated M. bovis vaccine and challenge with M. marinum in the zebrafish model number PR-2017-05-12.” Fästingar erhölls från laboratoriekolonin, där representativa prover av fästingar i kolonin testades med PCR för vanliga fästingpatogenerför att bekräfta frånvaron av patogener och upprätthöl…

Representative Results

Protokollet som presenteras här är baserat på flera aspekter av tidigare publicerade experiment 27,30 och resultat utförda i vårt laboratorium där zebrafiskmodellen är etablerad och validerad för studier av AGS och immunsvaret mot α-Gal eftersom både människor och zebrafisk inte syntetiserar denna molekyl13. Denna modell möjliggör karakterisering och utvärdering av en mängd olika allergiska reaktioner som ett resultat av vä…

Discussion

Zebrafisk är en kostnadseffektiv och lätthanterlig modell som också har varit ett mycket genomförbart verktyg för studier av molekylära mekanismer för immunsvaret, patogena sjukdomar, nya läkemedelstester och vaccination och skydd mot infektioner^33,34,35. Studien om zebrafiskens beteende är användbar eftersom tidigare studier har visat att vissa fiskarter förblir rörliga i botten av tanken när de är stressade, vilk…

Materials

1.5 mL tube	VWR	525-0990
All Prep DNA/RNA	Qiagen	80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Disection set	VWR	631-1279
Dog Food – Red Classic	Acana
ELISA plates-96 well	Thermo Fisher Scientific	10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)	Dextra	NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix	Supermix	1708840
Microliter syringes	Hamilton	7638-01
Plate reader	any
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Pipette tip P10	VWR	613-0364
Pipette tip P1000	VWR	613-0359
Premium food tropical fish	DAPC
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
Stereomicroscope	any
Thermal Cycler Real-Time PCR	any
Tricaine methanesulphonate (MS-222)	Sigma	E10521