Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

유전자 코드 확장을 이용한 박테리아 분비 단백질의 초고해상도 이미징

Published: February 10, 2023

doi:

Moirangthem Kiran Singh, Linda J. Kenney

¹Biochemistry & Molecular Biology,University of Texas Medical Branch

Summary

이 기사는 유전자 코드 확장(GCE) 부위 특이적 표지를 사용하여 살모넬라균 분비 이펙터에 라벨을 붙이고 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 이미지화하는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공합니다

Abstract

유형 3 분비 시스템(T3SSs)은 그람 음성 박테리아가 진핵 숙주 세포의 세포질에 직접 이펙터 단백질 배터리를 주입할 수 있도록 합니다. 진입 시 주입된 이펙터 단백질은 진핵 생물 신호 전달 경로를 협력적으로 조절하고 세포 기능을 재프로그래밍하여 박테리아 진입 및 생존을 가능하게 합니다. 감염의 맥락에서 이러한 분비된 이펙터 단백질을 모니터링하고 국소화하는 것은 숙주-병원체 상호작용의 동적 인터페이스를 정의하기 위한 발자국을 제공합니다. 그러나 숙주 세포의 구조/기능을 방해하지 않고 박테리아 단백질을 표지하고 이미징하는 것은 기술적으로 어렵습니다.

형광 융합 단백질을 구성하는 것은 융합 단백질이 분비 장치를 방해하여 분비되지 않기 때문에 이 문제를 해결하지 못합니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 우리는 최근 유전자 코드 확장(GCE)을 사용하여 박테리아 분비 이펙터 및 기타 라벨링하기 어려운 단백질의 부위 특이적 형광 라벨링 방법을 채택했습니다. 이 논문은 GCE 부위를 사용하여 살모넬라 분비 이펙터를 라벨링하는 완전한 단계별 프로토콜을 제공한 다음 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포내 국소화를 이미징하는 지침을 제공합니다

최근 연구 결과에 따르면 GCE를 통한 비표준 아미노산(ncAA)의 통합에 이어 테트라진 함유 염료를 사용한 생체 직교 표지는 박테리아 분비 단백질의 선택적 표지 및 시각화 및 숙주에서의 후속 이미지 분석을 위한 실행 가능한 기술입니다. 이 기사의 목표는 박테리아와 바이러스의 다양한 생물학적 과정과 숙주-병원체 상호 작용을 연구하기 위해 GCE를 사용하여 초고해상도 이미징을 수행하는 데 관심이 있는 조사자가 사용할 수 있는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

Introduction

박테리아 감염은 오랫동안 인체 건강에 심각한 위험으로 간주되어 왔습니다. 병원체는 숙주 면역 반응을 회피하고 감염을 확립하기 위해 다양한 박테리아 독성 인자(이펙터 단백질이라고 함)뿐만 아니라 고도로 진화되고 매우 강력하며 복잡한 방어 시스템을 사용합니다 ^1,2. 그러나, 이러한 시스템의 기초가 되는 분자 메커니즘과 개별 이펙터 단백질의 역할은 병인 동안 숙주 세포에서 중요한 단백질 성분 및 이펙터를 직접 따르기 위한 적절한 접근법의 부족으로 인해 여전히 거의 알려지지 않았습니다.

한 가지 전형적인 예는 급성 위장염을 유발하는 Salmonella enterica serovar Typhimurium입니다. 살모넬라균 Typhimurium은 유형 3 분비 시스템 (T3SS)을 사용하여 다양한 이펙터 단백질을 숙주 세포에 직접 주입합니다. 살모넬라균은 숙주 세포에 들어가자마자 살모넬라균 함유 액포(SCV)라고 하는 산성 막 결합 구획에 존재합니다.^3,4. SCV의 산 pH는 살모넬라 병원성 섬 2(SPI-2)로 인코딩된 T3SS를 활성화하고 액포막을 가로질러 20개 이상의 이펙터 단백질의 발리를 숙주 세포질 5,6,7,8로 전위시킵니다. 숙주 내부에서, 이펙터 단백질의 이러한 복잡한 칵테일은 숙주 세포 신호 전달 경로를 조정하여 살모넬라 유도 필라멘트(SIF)라고 하는 미세소관을 따라 SCV에서 확장된 매우 역동적이고 복잡한 관형 막 구조를 형성하여 살모넬라균이 숙주 세포 내에서 생존하고 복제할 수 있도록 합니다^9,10,11.

박테리아 이펙터 국소화를 시각화, 추적 및 모니터링하고 숙주 세포 내부의 트래피킹 및 상호 작용을 조사하는 방법은 박테리아 발병을 뒷받침하는 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 숙주 세포 내에서 살모넬라균 분비 T3SS 이펙터 단백질의 표지 및 국소화는 기술적 과제임이 입증되었습니다^12,13; 그럼에도 불구하고 유전적으로 암호화된 형광 단백질의 개발은 살아있는 시스템 내에서 단백질을 연구하고 시각화하는 우리의 능력을 변화시켰습니다. 그러나 형광 단백질의 크기(~25-30 kDa)15는 종종 관심 단백질의 크기와 비슷하거나 더 큽니다(POI; 예: SsaP의 경우 ^13.65 kDa, SifA의 경우 37.4 kDa). 실제로, 이펙터의 형광 단백질 표지는 종종 표지된 이펙터의 분비를 차단하고 T3SS¹⁴를 방해합니다.

또한, 형광 단백질은 덜 안정적이고, 광표백 전에 적은 수의 광자를 방출하여, 초해상도 현미경 기술(^16,17,18), 특히 광활성화 국소화 현미경(PALM), STORM 및 자극 방출 고갈⁽STED) 현미경에서의 사용을 제한한다. 유기 형광 염료의 광물리적 특성은 형광 단백질의 광물리적 특성보다 우수하지만, CLIP/SNAP^19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 및 HA-Tags ^24,25와 같은 방법/기술은 번역 후 변형 또는 트래피킹을 방해하여 관심 있는 이펙터 단백질의 구조-기능을 손상시킬 수 있는 추가 단백질 또는 펩타이드 부속물을 필요로 합니다. 필요한 단백질 변형을 최소화하는 대체 방법은 GCE를 통한 번역 중에 ncAA를 POI에 통합하는 것입니다. ncAA는 형광성이거나 클릭 화학 12,13,26,27,28을 통해 형광으로 만들 수 있습니다.

GCE를 사용하면 작고 기능적인 생체 직교 그룹(예: 아자이드, 사이클로프로펜 또는 사이클로옥틴 그룹)을 가진 ncAA를 표적 단백질의 거의 모든 위치에 도입할 수 있습니다. 이 전략에서, 천연 코돈은 POI의 유전자의 특정 위치에서 호박 (TAG) 정지 코돈과 같은 희귀 코돈으로 스왑된다. 변형된 단백질은 직교 아미노아실-tRNA 합성효소/tRNA 쌍과 함께 세포에서 연속적으로 발현됩니다. tRNA 합성효소 활성 부위는 하나의 특정 ncAA만을 수용하도록 설계되며, 이는 호박색 코돈을 인식하는 tRNA의 3′-말단에 공유 결합됩니다. ncAA는 단순히 성장 배지에 도입되지만 세포에 흡수되어 아미노아실-tRNA 합성효소(aaRS)가 직교 tRNA에 연결할 수 있는 세포질에 도달해야 합니다. 그런 다음 지정된 위치의 POI에 통합됩니다(그림 1 참조)¹². 따라서, GCE는 케톤, 아자이드, 알킨, 시클로옥틴, 트랜스시클로옥텐, 테트라진, 노르보넨, α, β-불포화 아미드 및 비시클로[6.1.0]-노닌과 같은 과다한 생체 직교 반응성 그룹의 부위 특이적 통합을 가능하게 하여 잠재적으로 기존의 단백질 표지 방법 12,26,27,28의 한계를 극복합니다.

초고해상도 이미징 기술의 최근 새로운 트렌드는 분자 수준에서 생물학적 구조를 조사할 수 있는 새로운 길을 열었습니다. 특히, 단일 분자, 국소화 기반, 초분해능 기술인 STORM은 세포 구조를 ~20-30nm까지 시각화하는 데 매우 유용한 도구가 되었으며, 한 번에 한 분자씩 생물학적 과정을 조사할 수 있어 기존의 앙상블 평균 연구에서는 아직 알려지지 않은 세포 내 분자의 역할을 발견할 수 있습니다¹³ . 단일 분자 및 초분해능 기술에는 최상의 분해능을 위해 밝고 광안정성이 있는 유기 형광단이 있는 작은 태그가 필요합니다. 우리는 최근에 GCE가 초고해상도 이미징¹²에 적합한 프로브를 통합하는 데 사용될 수 있음을 입증했습니다.

세포에서 단백질 표지를 위한 최선의 선택 중 두 가지는 바이사이클로[6.1.0] 노니넬리신(BCN) 및 트랜스-사이클로옥텐-라이신(TCO, 그림 1에 표시됨)이며, 이는 tRNA/합성효소 쌍(여기서는 tRNA Pyl/PylRS AF라고 함)의 변이체를 사용하여 유전적으로 암호화될 수 있으며, 여기서^Pyl은 피롤리신을 나타내고^AF는 자연적으로 피롤리신¹²를 암호화하는 Methanosarcina mazei에서 파생된 합리적으로 설계된 이중 돌연변이(Y306A, Y384F)를 나타냅니다^. 29,30,31. 균주 촉진 역 전자 수요 Diels-Alder 고리 첨가 (SPIEDAC) 반응을 통해 이러한 아미노산은 테트라 진 접합체와 화학 선택적으로 반응합니다 (그림 1) 12,30,31. 이러한 고리첨가 반응은 매우 빠르고 살아있는 세포와 호환됩니다. 이들은 또한 적절한 형광단이 테트라진 잔기 ^12,26,32로 기능화되는 경우 형광성일 수 있다. 이 논문은 GCE를 사용하여 숙주 세포로 전달되는 박테리아 이펙터의 역학을 모니터링한 후 dSTORM을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 결과는 GCE를 통한 ncAA의 통합에 이어 형광 생성 테트라진 함유 염료와의 클릭 반응이 선택적 라벨링, 분비된 단백질의 시각화 및 숙주에서의 후속 세포 내 국소화를 위한 다양한 방법을 나타낸다는 것을 나타냅니다. 그러나 여기에 설명 된 모든 구성 요소와 절차는 GCE 시스템이 다른 생물학적 질문을 조사하도록 조정할 수 있도록 조정하거나 대체 할 수 있습니다.

Protocol

1. 플라스미드 구성 POI를 발현하는 유전자를 대장균 BL21(DE3)에서 POI를 발현하는 발현 플라스미드(예: pET28a-sseJ 10TAG)로 클로닝합니다. 이 단계는 돌연변이체가 기능적인지 결정하는 것을 용이하게 합니다. 숙주 세포에서 살모넬라 분비 이펙터의 시각화를 위해, 이전 보고서 7,12,24에 설명된 바와 같이, 그의 천연 프로모터의 제어 하에…

Representative Results

이 프로토콜 논문은 그림 1과 같이 살모넬라균 분비 이펙터의 부위별 형광 라벨링 및 시각화를 위한 GCE 기반 방법을 설명합니다. 트랜스사이클로옥텐 생체직교기(TCO) 및 형광 염료를 담지한 ncAA의 화학 구조는 도 1A에 나타내었다. SseJ 표지는 GCE 기술을 통해 직교 아미노아실-tRNA 합성효소/tRNA 쌍을 사용하여 호박색 …

Discussion

본원에 기재된 접근법은 감염 후 박테리아 T3SS에 의해 숙주 세포 내로 주입된 이펙터 단백질의 정확한 위치를 추적하기 위해 사용되었다. T3SS는 살모넬라균, 시겔라균 및 예르시니아와 같은 세포내 병원체에 의해 사용되어 독성 성분을 숙주로 운반합니다. 초고해상도 이미징 기술의 개발로 이전에는 상상할 수 없었던 해상도^12,13,24<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 텍사스 주 갤버스턴에 있는 텍사스 대학교 의과대학 지부의 창업 자금과 L.J.K.에 대한 텍사스 STAR 어워드의 지원을 받았습니다. 플라스미드 pEVOL-PylRS-AF에 대해 Edward Lemke 교수(유럽 분자 생물학 연구소, 독일 하이델베르크)에게 감사드립니다. 그림 1 의 이미지는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.

Materials

10x Tris/Glycine SDS running buffer	BIO-RAD	1610732
Ammonium chloride	Fischer Scientific	A661-500
Ammonium sulphate	Fischer Scientific	BP212R-1
Ampicillin Sodium	Sigma-Aldrich	A0166	5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x)	ThermiFischer Scientific	15240096
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge)	Beckman Coulter
Bacto-Agar	BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA	214010
BDP-FL-tetrazine	Lumiprobe (USA)	2.14E+02
β-mercaptoethanol	Millipore	444203	250 mL
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B8026
BSA	Sigma-Aldrich	A4503	500 g
Casein	Sigma-Aldrich	C8654
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L – Lysine (TCO*A)	SiChem GmbH	SC-8008	Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342)	Invitrogen	H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer	DeNovix
DMEM*	Corning	10-013-CV	* Used for maintaining HeLa Cell
DMEM**	Gibco	11965-092	**Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody	Invitrogen	A-31572
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3)	Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera	Andor	iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean)	Eppendorf, Hamburg, Germany	30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fischer	10082147
Fisherbrand Syringe Filters – Sterile (PVDF 0.22 µm)	Fischer Scientific	97203	Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator	BIO-RAD	1652660
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x	Fischer Scientific	25-030-081
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G7141-50KU
Glycerol	Fischer Scientific	BF229-4
HeLa cells	ATTC	CCL-2
HEPES Buffer	Corning	25-060-C1	100 mL
Hydrocloric acid	Fischer Scientific	A144-212
ImageJ			Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue	Expedeon	ISB1L	Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine	Tocris Bioscience	7279
Kanamycin	Sigma-Aldrich	60615	5 g
LB Broth	BD Difco	244620	500 g
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
μManager (v. 1.4.2)			https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES	Sigma-Aldrich	M3671	250 g
Micro pulser cuvette	BIO-RAD	165-2086	0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM	Nikon Instruments Inc.		https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks	ThermiFischer Scientific	156499
Omnipur Casamino Acid	Calbiochem	2240	500 g
Paraformaldehhyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (10x)	Roche	11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010	100 mL
pEVOL-PylRS-AF			For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit	Qiagen	27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA			Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127	Millipore	540025	Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic	Fischer Scientific	P285-500
Potassium sulphate	Acros Organic	424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I – Calbiochem	Sigma-Aldrich	539131	100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody	Sigma-Aldrich	H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s			Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin	Sigma-Aldrich	47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium hydroxide	Fischer Scientific	SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x	Corning	25-060-C1	100 mL
Sonic Dismembrator Model 100	Fischer Scientific	24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system)	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany		https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM			https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%	GenDEPOT	CA014-010
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416	100 mL
X-well tissue culture chamber slides	SARSTEDT	94.6190.802

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Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).