Præsenteret her er en protokol til pålideligt at kvantificere højre og venstre ventrikulær funktion af donorhjerter efter kold konservering ved hjælp af et ex vivo perfusionssystem.
Primær transplantatdysfunktion (PGD) er fortsat den hyppigste årsag til tidlig død efter hjertetransplantation. Langvarig iskæmisk tid under kuldekonservering er en vigtig risikofaktor for PGD, og pålidelig evaluering af hjertefunktionen er afgørende for at studere donorhjertets funktionelle reaktioner efter kuldekonservering. Den ledsagende video beskriver en teknik til vurdering af murin højre og venstre ventrikelfunktion ved hjælp af ex vivo perfusion baseret på en Langendorff-model efter kuldekonservering i forskellige varigheder. Kort sagt isoleres hjertet og opbevares i en kold histidin-tryptophan-ketoglutarat (HTK) opløsning. Derefter perfuseres hjertet med en Kreb-buffer i en Langendorff-model i 60 min. En silikoneballon indsættes i venstre og højre ventrikel, og hjertefunktionsparametre registreres (dP / dt, trykvolumenforhold). Denne protokol tillader pålidelig evaluering af hjertefunktion efter forskellige hjertebevaringsprotokoller. Det er vigtigt, at denne teknik tillader undersøgelse af hjertebevaringsresponser specifikt i indfødte hjerteceller. Brugen af meget små murinhjerter giver adgang til et enormt udvalg af transgene mus for at undersøge mekanismerne i PGD.
Hjertetransplantation forbedrer overlevelsen og livskvaliteten hos patienter med hjertesvigt i slutstadiet1. Desværre begrænser manglen på hjertedonorer antallet af patienter, der kunne drage fordel af denne behandling og begrænser klinikernes evne til optimalt at matche donorer med modtagere 2,3,4. Desuden har det nye tildelingssystem bidraget til længere iskæmiske tider og øget brugen af marginale donorer betydeligt siden 20185. Derfor øges gennemsnitsalderen for hjertedonorer og den iskæmiske tid over tid, hvilket fører til en højere grad af primær transplantatdysfunktion (PGD) på trods af betydelige forbedringer i strategierne for hjertebevarelse 6.
PGD kan påvirke venstre, højre eller begge ventrikler og forbliver en livstruende komplikation, der repræsenterer den førende årsag til tidlige dødsfald efter hjertetransplantation. Undersøgelse af mekanismerne i PDG og udvikling af strategier for bedre hjertebevarelse er vigtige overvejelser i betragtning af den potentielle livreddende indvirkning på hjertemodtagere. Derfor er eksperimentelle modeller, der muliggør en robust og pålidelig vurdering af donorhjertefunktionen efter en længere opbevaringstid, afgørende for at øge vores forståelse af PGD og lette udviklingen af nye terapier. Evnen til nøjagtigt at vurdere hjertefunktionen i musehjertet giver adgang til et stort repertoire af transgene murinmodeller, der nøjagtigt kan identificere PGD-mekanismer.
I fysiologiske og farmakologiske undersøgelser anvendes Langendorff retrograd perfusionsmodellen i vid udstrækning til at vurdere hjertefunktion7. Specifikt detekteres hjerteydelse af en silikoneballon forbundet til en tryktransducer i venstre ventrikulære (LV) hulrum. Et centralt træk ved PGD er utilstrækkelig sammentrækning og afslapning af ventrikelmusklen. Tidligere Langendorff-undersøgelser har fokuseret på at bruge en LV-ballon til at producere pålidelige og reproducerbare resultater i LV-funktionsvurdering 8,9,10. Imidlertid er brugen af en intracavitær ballon til vurdering af højre ventrikulær (RV) funktion ved hjælp af ballonsystemet mindre anerkendt.
I betragtning af en signifikant PGD-hastighed, der involverer RV efter transplantation11, ville eksperimentelle metoder til undersøgelse af både LV- og RV-funktion hjælpe med at bestemme de molekylære og fysiologiske mekanismer, der bidrager til RV PGD. Denne protokol viser, at intracavitære silikoneballoner kan give pålidelige vurderinger af LV- og RV-funktion i det samme murinhjerte12. For at evaluere den potentielle anvendelse af Langendorff-systemet i PGD-undersøgelsen undersøgte vi hjertefunktionerne med forskellige opbevaringsperioder og fandt nedsat hjertefunktion ved sammentrækning og afslapning ved langvarig kold opbevaring af murinhjerter. Interessant nok har LV en højere funktionel reduktion end RV. Sammenfattende kan protokollen beskrevet her bruges til at vurdere effekten af et kandidatlægemiddel og molekylære veje på både LV- og RV-funktion. Evnen til at anvende denne metode på murinhjerter vil lette udførelsen af detaljerede mekanistiske undersøgelser.
Denne protokol beskriver retrograd perfusion Langendorff-metoden via aortakanylering. Denne teknik kan bruges til at evaluere LV og RV funktion af murine hjerter efter kold opbevaring. Resultaterne viser, at langvarig køleopbevaring af donorhjerter fører til nedsat hjertefunktion i både LV og RV ved hjælp af denne protokol.
Studierne af akut og kronisk afstødning efter hjertetransplantation fokuserer bredt på immunbiologi14. Virkningerne af indfødte celler på PGD under kold opbevaring undersøges mindre godt. PGD forekommer i ~ 10% -20% af hjertetransplantationer og tegner sig for 66% af tidlig død inden for 30 dage efter transplantation. Især forekomsten af PGD, der påvirker LV versus RV, varierer efter transplantation11. Uden bidrag fra modtagercellulære responser fokuserer denne ex vivo-metode på indfødte hjertecellers bidrag til PGD efter kold konservering af donorhjerter. Yderligere undersøgelser kan inkorporere modtagerresponser i en murin hjertetransplantationsmodel.
I denne protokol fokuserede Langendorff-perfusionen af koldt bevarede donorhjerter på de indfødte hjerteresponser på varm krystalloid perfusion uden at infiltrere cellulær immunitet. For at opnå reproducerbare resultater blev flere kritiske trin standardiseret. Musens hjerter blev arresteret ved hjælp af HTK-opløsning og opbevaret i iskold HTK, svarende til klinisk praksis. HTK-opløsningens perfusionsvolumen og infusionstid for hvert hjerte blev nøje overvåget med en timer. Donorhjertet blev opbevaret i forkølede rør på is indeholdende HTK i et rum med 4 °C. Kanyleringstiden blev standardiseret til ~ 3 minutter før perfusion. Alle disse trin sikrede, at varigheden af kuldekonservering var den største variabel i undersøgelsen.
En periode med uregelmæssig hjertekontraktilitet i ~ 20 minutter blev almindeligt set i begyndelsen af perfusionen. Denne ligevægts- og restitutionsperiode blev lettet ved gradvis opvarmning og iltning af hjertevæv. En relativt stabil periode forventedes efter de første 20 min. Ballonen blev indsat i ventrikelhulen ~ 18 minutter efter den indledende ligevægtsperiode. Vi begyndte at registrere hæmodynamik, efter at hjertet var stabilt i ~ 25 minutter, når ballonen blev indsat. Perfusion med KH-buffer opretholdt stabil hjerteydelse i ~ 1,5-2 timer. Vi valgte derfor at registrere hæmodynamik i 20 min i hver af venstre og højre ventrikler.
Der er flere begrænsninger af retrograd perfusion for at studere PGD af hjerter efter kold opbevaring. For det første på grund af ballonstørrelsen og manglen på plads i hvert ventrikulært hulrum (især RV) er den samtidige indsættelse af to balloner i både LV og RV meget udfordrende. Således måler vi funktionen af RV og LV sekventielt. Det er vigtigt at bemærke, at det interventrikulære septum bidrager væsentligt til både venstre og højre ventrikulær funktion. Septumet bidrager til ~ 50% af højre ventrikulær funktion, så der er interventrikulær afhængighed15. Det er også vigtigt at bemærke, at mens procedurerne for reperfusion af murinhjertet i Langendorff-enheden tager ~ 3 minutter, tager kirurgisk implantation af det menneskelige hjerte i det relativt varme kirurgiske felt ~ 45 minutter. Til sammenligning pådrager murinhjertet i dette Langendorff-system mindre iskæmisk tid. Dette bør tages i betragtning, når klinisk oversættelse overvejes.
Da vi brugte KH-buffer til at perfusere hjertet uden blod, kan dette også have mindre effektivitet i ilttilførsel. Imidlertid er hjertefunktionen relativt stabil gennem de indledende 1,5-2 timers perfusion, hvilket muliggør pålidelige hæmodynamiske målinger. Desværre er der i øjeblikket ingen levedygtige arbejdshjerteperfusionsmodeller for disse mindre murine hjerter, og effekten af ventrikulær belastning kan ikke evalueres i dette system. På trods af dette er perfusionssystemet meget reproducerbart og mindre arbejdskrævende og tidskrævende end transplantationsmodeller. Det er også billigere end transplantationsundersøgelser, hvilket kan gøre det mere egnet til screening af forskellige terapeutiske muligheder og forskellige molekylære veje. Med ændringer af konserveringsløsninger ved at tilføje kandidatlægemidler kan denne platform bruges til at evaluere virkningerne af farmakologiske midler på reduktion af PGD i både LV og RV.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
4-0 silk suture | Braintree Scientific | SUTS108 | |
6-0 Silk suture | Braintree Scientific | SUTS104 | |
All purpose flour | Kroger | ||
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G | Fisher scientific | 14-826-5A | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) | Fisher scientific | 14-823-16E | |
Corn Syrup | Kroger | ||
Custodiol HTK Solution | Essential Pharmaceuticals LLC | ||
Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 14393/14394 | |
Falcon 50 mL conical tubes | Fisher scientific | 14-959-49A | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H4784 | |
Krebs Henseleit buffer | Sigma | K3753 | |
Nusil silicone dispersions | Avantor | ||
Perfusion system | Radnoti | 130101BEZ | |
PowerLab | ADInstruments | PL3508 | |
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Xylazine | Sigma | X1126 |