Presentert her er en protokoll for pålitelig kvantifisering av høyre og venstre ventrikkelfunksjon av donorhjerter etter kuldekonservering ved hjelp av et ex vivo perfusjonssystem.
Primær transplantatdysfunksjon (PGD) er fortsatt den viktigste årsaken til tidlig død etter hjertetransplantasjon. Forlenget iskemisk tid under kuldekonservering er en viktig risikofaktor for PGD, og pålitelig evaluering av hjertefunksjonen er avgjørende for å studere donorhjertets funksjonelle responser etter kuldekonservering. Den medfølgende videoen beskriver en teknikk for å vurdere murine høyre og venstre ventrikkelfunksjon ved hjelp av ex vivo perfusjon basert på en Langendorff-modell etter kuldekonservering i forskjellige varigheter. Kort fortalt isoleres hjertet og lagres i en kald histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) løsning. Deretter perfuseres hjertet med en Krib-buffer i en Langendorff-modell i 60 minutter. En silikonballong settes inn i venstre og høyre ventrikkel, og hjertefunksjonelle parametere registreres (dP / dt, trykk-volumforhold). Denne protokollen tillater pålitelig evaluering av hjertefunksjonen etter forskjellige hjertebevaringsprotokoller. Det er viktig at denne teknikken tillater studier av hjertebevarelsesresponser spesielt i innfødte hjerteceller. Bruken av svært små murinhjerter gir tilgang til et enormt utvalg av transgene mus for å undersøke mekanismene bak PGD.
Hjertetransplantasjon bedrer overlevelse og livskvalitet hos pasienter med hjertesvikt i sluttstadiet1. Dessverre begrenser mangelen på hjertedonorer antall pasienter som kan ha nytte av denne behandlingen og begrenser klinikernes evne til å matche donorer optimalt med mottakere 2,3,4. Videre har det nye tildelingssystemet bidratt til lengre iskemiske tider og økt bruken av marginale givere betydelig siden 20185. Følgelig øker gjennomsnittsalderen for hjertedonorer og iskemisk tid over tid, noe som fører til en høyere forekomst av primær transplantatdysfunksjon (PGD) til tross for betydelige forbedringer i strategiene for hjertebevaring 6.
PGD kan ramme venstre, høyre eller begge ventriklene, og er fortsatt en livstruende komplikasjon som representerer den viktigste årsaken til tidlige dødsfall etter hjertetransplantasjon. Undersøkelse av mekanismene til PDG og utvikling av strategier for bedre hjertebevaring er viktige hensyn, gitt den potensielle livreddende effekten på hjertemottakere. Derfor er eksperimentelle modeller som muliggjør en robust og pålitelig vurdering av donorhjertefunksjon etter forlenget lagringstid, avgjørende for å øke vår forståelse av PGD og legge til rette for utvikling av nye terapier. Evnen til nøyaktig å vurdere hjertefunksjonen i musehjertet gir tilgang til et stort repertoar av transgene murinmodeller som nøyaktig kan identifisere PGD-mekanismer.
I fysiologiske og farmakologiske studier er Langendorff retrograd perfusjonsmodell mye brukt til å vurdere hjertefunksjon7. Spesielt oppdages hjerteytelsen av en silikonballong koblet til en trykktransduser i venstre ventrikkel (LV) hulrom. Et sentralt trekk ved PGD er utilstrekkelig sammentrekning og avslapning av ventrikkelmuskelen. Tidligere Langendorff-studier har fokusert på å bruke en LV-ballong for å produsere pålitelige og reproduserbare resultater i LV funksjonsvurdering 8,9,10. Imidlertid er bruken av en intrakavitær ballong for å vurdere høyre ventrikulær (RV) funksjon ved hjelp av ballongsystemet mindre godt anerkjent.
Gitt en signifikant PGD-rate som involverer RV etter transplantasjon11, vil eksperimentelle metoder for å studere både LV- og RV-funksjon bidra til å bestemme molekylære og fysiologiske mekanismer som bidrar til RV PGD. Denne protokollen viser at intrakavitære silikonballonger kan gi pålitelige vurderinger av LV- og RV-funksjon i samme murine heart12. For å evaluere den potensielle bruken av Langendorff-systemet i PGD-studien, undersøkte vi hjertefunksjonene med ulike lagringsperioder og fant nedsatt hjertefunksjon ved sammentrekning og relaksasjon med langvarig kuldelagring av murinhjerter. Interessant nok har LV en høyere funksjonsreduksjon enn RV. Oppsummert kan protokollen beskrevet her brukes til å vurdere effekten av et kandidatmedikament og molekylære veier på både LV- og RV-funksjon. Evnen til å bruke denne metoden på murine hjerter vil lette utførelsen av detaljerte mekanistiske studier.
Denne protokollen beskriver retrograd perfusjon Langendorff-metoden via aortakanylering. Denne teknikken kan brukes til å evaluere LV- og RV-funksjonen til murinhjerter etter kald lagring. Resultatene viser at langvarig kjølelagring av donorhjerter fører til redusert hjertefunksjon i både LV og RV ved hjelp av denne protokollen.
Studiene av akutt og kronisk avstøtning etter hjertetransplantasjon fokuserer mye på immunbiologi14. Effekten av stedegne celler på PGD under kjølelagring er mindre godt undersøkt. PGD forekommer hos ~10%-20% av hjertetransplantasjoner og står for 66% av tidlig død innen 30 dager etter transplantasjon. Spesielt er forekomsten av PGD som påvirker LV versus RV forskjellig etter transplantasjon11. Uten bidrag fra mottakerens cellulære responser, fokuserer denne ex vivo-metoden på bidragene fra innfødte hjerteceller til PGD etter kuldekonservering av donorhjerter. Videre studier kan inkludere mottakerresponser i en murine hjertetransplantasjonsmodell.
I denne protokollen fokuserte Langendorff-perfusjonen av kaldbevarte donorhjerter på de opprinnelige hjerteresponsene på varm krystalloid perfusjon uten å infiltrere cellulær immunitet. For å oppnå reproduserbare resultater ble flere kritiske trinn standardisert. Musehjertene ble arrestert ved hjelp av HTK-løsning og lagret i iskald HTK, tilsvarende klinisk praksis. Perfusjonsvolumet og infusjonstiden for HTK-oppløsningen for hvert hjerte ble nøye overvåket med en timer. Donorhjertet ble oppbevart i forkjølte rør på is med HTK i et rom på 4 °C. Kanyleringstiden waas standardisert til ~ 3 min før perfusjon. Alle disse trinnene sørget for at kuldekonserveringsvarighet var den viktigste variabelen i studien.
En periode med uregelmessig hjertekontraktilitet i ~20 min ble ofte sett i begynnelsen av perfusjonen. Denne likevekts- og gjenopprettingsperioden ble tilrettelagt ved gradvis oppvarming og oksygenering av hjertevev. Det var ventet en relativt stabil periode etter de første 20 min. Ballongen ble satt inn i ventrikkelhulen ved ~18 min etter den første likevektsperioden. Vi begynte å registrere hemodynamikk etter at hjertet var stabilt i ~25 min, når ballongen ble satt inn. Perfusjon med KH-buffer opprettholdt stabil hjerteytelse i ~1,5-2 timer. Vi valgte derfor å registrere hemodynamikk i 20 min i hver av venstre og høyre ventrikler.
Det er flere begrensninger ved retrograd perfusjon for å studere hjertets PGD etter kald lagring. For det første, på grunn av ballongstørrelsen og mangel på plass i hvert ventrikkelhulrom (spesielt RV), er samtidig innsetting av to ballonger i både LV og RV svært utfordrende. Dermed måler vi funksjonen til RV og LV sekvensielt. Det er viktig å merke seg at interventrikulær septum bidrar betydelig til både venstre og høyre ventrikulær funksjon. Septum bidrar til ~ 50% av høyre ventrikulær funksjon, så det er interventrikulær avhengighet15. Det er også viktig å merke seg at mens prosedyrene for reperfusjon av murine hjertet i Langendorff-enheten tar ~ 3 min, tar kirurgisk implantasjon av det menneskelige hjertet i det relativt varme kirurgiske feltet ~ 45 min. Til sammenligning pådrar murine hjertet i dette Langendorff-systemet mindre iskemisk tid. Dette bør tas i betraktning ved vurdering av klinisk oversettelse.
Siden vi brukte KH-buffer til å perfusere hjertet uten blod, kan dette også ha mindre effektivitet i oksygentilførsel. Imidlertid er hjertefunksjonen relativt stabil gjennom de første 1,5-2 timer med perfusjon, og tillater dermed pålitelige hemodynamiske målinger. Dessverre er det for tiden ingen levedyktige fungerende hjerteperfusjonsmodeller for disse mindre murinhjertene, og effekten av ventrikkelbelastning kan ikke evalueres i dette systemet. Til tross for dette er perfusjonssystemet svært reproduserbart og mindre arbeidskrevende og tidkrevende enn transplantasjonsmodeller. Det er også mindre kostbart enn transplantasjonsstudier, noe som kan gjøre det mer egnet for screening av ulike terapeutiske alternativer og ulike molekylære veier. Med modifikasjoner av konserveringsløsninger ved å legge til kandidatmedisiner, kan denne plattformen brukes til å evaluere effekten av farmakologiske midler på å redusere PGD i både LV og RV.
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
4-0 silk suture | Braintree Scientific | SUTS108 | |
6-0 Silk suture | Braintree Scientific | SUTS104 | |
All purpose flour | Kroger | ||
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G | Fisher scientific | 14-826-5A | |
BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) | Fisher scientific | 14-823-16E | |
Corn Syrup | Kroger | ||
Custodiol HTK Solution | Essential Pharmaceuticals LLC | ||
Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 14393/14394 | |
Falcon 50 mL conical tubes | Fisher scientific | 14-959-49A | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H4784 | |
Krebs Henseleit buffer | Sigma | K3753 | |
Nusil silicone dispersions | Avantor | ||
Perfusion system | Radnoti | 130101BEZ | |
PowerLab | ADInstruments | PL3508 | |
Sodium azide | Sigma | S2002 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Xylazine | Sigma | X1126 |