通过工程、条形码和筛选腺相关病毒 （AAV） 衣壳变体分离下一代基因治疗载体
Summary
AAV肽显示文库生成，随后通过条形码对具有新颖特性的候选物进行验证，以创建下一代AAV。
Abstract
源自腺相关病毒（AAV）的基因递送载体是治疗遗传疾病的最有前途的工具之一，令人鼓舞的临床数据和几种AAV基因疗法的批准证明了这一点。AAV载体成功的两个主要原因是（i）先前分离出具有不同特性的各种天然存在的病毒血清型，以及（ii）随后建立了强大的分子工程技术，并在高通量中再利用。最近实施的策略进一步提高了这些技术的潜力，用于在DNA和RNA水平上对选定的AAV衣壳进行条形码编码，允许它们在单个动物的所有主要器官和细胞类型中进行全面和平行的 体内 分层。在这里，我们提出了一个包含这组互补途径的基本管道，使用 AAV 肽显示来代表可用衣壳工程技术的各种库。因此，我们首先描述了生成AAV肽显示库的关键步骤，用于 体内 选择具有所需特性的候选药物，然后演示如何对最有趣的衣壳变体进行条形码编码以进行二次 体内 筛选。接下来，我们举例说明了创建用于下一代测序（NGS）文库的方法，包括条形码扩增和衔接连接，最后概述了NGS数据分析中最关键的步骤。由于这里报告的协议是通用和适应性强的，研究人员可以很容易地利用它们来丰富他们最喜欢的疾病模型中的最佳AAV衣壳变体和基因治疗应用。
Introduction
基因转移疗法是在细胞中引入遗传物质以修复、替换或改变细胞遗传物质，以预防、治疗、治愈或改善疾病。体内和离体基因转移依赖于不同的递送系统，非病毒和病毒。病毒已经自然进化，可以有效地转导其靶细胞，并可用作递送载体。在基因治疗中使用的不同类型的病毒载体中，腺相关病毒已被越来越多地使用，因为它们缺乏致病性、安全性、低免疫原性，最重要的是它们能够维持长期、非整合的表达1，2，3。AAV基因治疗在过去十年中取得了相当大的成就;三种疗法已被欧洲药品管理局和美国食品和药物管理局批准用于人类3，4。一些临床试验也正在进行中，以治疗各种疾病，如血友病、肌肉、心脏和神经系统疾病，详见其他专题3。尽管取得了数十年的进步，但基因治疗领域近年来经历了一系列挫折4，最重要的是临床试验中的死亡5由于剂量限制性毒性而被搁置，特别是对于巨大的组织，如肌肉，或难以触及的组织，如大脑6。
目前用于临床试验的AAV载体属于天然血清型，但少数例外1。AAV工程为开发具有卓越器官或细胞特异性和效率的载体提供了机会。在过去的二十年中，已经成功应用了几种方法，例如肽显示，环交换，衣壳DNA洗牌，容易出错的PCR和靶向设计，以生成具有不同性质的单个AAV变体或其文库7。然后对它们进行多轮定向进化，以选择其中具有所需特性的变体，如其他地方1，3所述。在所有衣壳进化策略中，肽显示AAV文库使用最广泛，这是由于一些独特的性质：它们相对容易生成，并且可以实现高多样性和高通量测序，从而允许跟踪它们的进化。
第一个成功的肽插入AAV文库是在大约20年前描述的。在第一个中，Perabo等人8构建 了一个修饰的AAV2衣壳文库，其中随机生成的寡核苷酸池入质粒中，位置对应于VP1衣壳蛋白的氨基酸587，在从衣壳突出的三倍轴上。使用腺病毒混合感染，AAV文库通过多轮选择进化，最终的重新靶向变体被证明能够转导亲本AAV28难治的细胞系。此后不久，Müller等人9引入了 用于文库生产的两步系统，这是对该协议的重大改进。最初，质粒文库与腺病毒辅助质粒一起用于产生含有嵌合衣壳的AAV文库。该AAV穿梭文库用于感染低感染多重性（MOI）的细胞，目的是为每个细胞引入一个病毒基因组。与腺病毒的混合感染可确保产生具有匹配基因组和衣壳9的AAV。大约十年后，Dalkara10 使用 体内 定向进化创造了7m8变体。该变体具有10个氨基酸插入（LALGETTRPA），其中三个充当接头，并在玻璃体内注射后有效地靶向视网膜外层10。这种工程衣壳是一个非凡的成功故事，因为它是迄今为止为数不多的进入临床的工程衣壳之一11。
随着二代测序（NGS）技术的引入，该领域经历了第二次推动。Adachi et al.12 在 2014 年和 Marsic et al.13 在 2015 年的两篇出版物展示了 NGS 以高精度跟踪条形码 AAV 衣壳文库分布的能力。几年后，条形码区域的NGS适应肽插入区域以跟随衣壳的演变。Körbelin等人14进行了NGS引导的筛选，以确定基于肺靶向AAV2的衣壳。NGS分析有助于计算三个评分：选择轮之间的富集评分，确定组织特异性的一般特异性评分，最后是综合评分14。Gradinaru实验室15在同一年发表了基于Cre重组的AAV靶向进化（CREATE）系统，该系统有助于细胞类型特异性选择。在这个系统中，衣壳文库携带一个Cre可逆开关，因为polyA信号两侧有两个loxP位点。然后将AAV文库注射到Cre小鼠中，其中polyA信号仅在Cre+细胞中倒置，为反向PCR引物与衣壳基因内的正向引物结合提供模板。这种高度特异性的PCR救援能够鉴定AAV-PHP。可以穿过血脑屏障的B变体15。该系统进一步发展为M-CREATE（Multiplexed-CREATE），其中NGS和合成文库生成被集成到管道16中。
来自Maguire实验室17的基于RNA的改进版本iTransduce允许在DNA水平上选择功能转导细胞并表达其基因组的衣壳。肽显示文库的病毒基因组包括由普遍存在的启动子控制的Cre基因和在p41启动子控制下的衣壳基因。将该文库注射到tdTomato上游具有loxP-STOP-loxP盒的小鼠中。用AAV变体转导的细胞，这些变异体表达病毒基因组，因此Cre表达tdTomato，并与细胞标记结合，可以进行分类和选择17。类似地，Nonnenmacher等人18 和Tabebordbar等人19 将衣壳基因库置于组织特异性启动子的控制之下。注射不同动物模型后，使用病毒RNA分离衣壳变体。
另一种方法是使用条形码来标记衣壳库。Björklund实验室20 使用这种方法对肽插入衣壳文库进行条形码编码，并开发了条形码理性AAV载体进化（BRAVE）。在一个质粒中，将Rep2Cap盒克隆在倒置末端重复序列（ITR）侧向表达黄色荧光蛋白（YFP）的条形码标记转基因旁边。使用 帽 末端和条形码开头之间的loxP位点， 体外 Cre重组产生足够小的NGS片段，从而允许肽插入与唯一条形码（查找表，LUT）相关联。使用质粒文库进行AAV生产，并在 体内 应用后再次使用NGS20筛选mRNA中表达的条形码。当衣壳文库包含整个衣壳基因的变体（即洗牌文库）时，需要使用长读长测序。一些小组使用条形码来标记这些不同的库，这使得NGS具有更高的读取深度。Kay 实验室21 用 帽 polyA 信号下游的条形码标记了高度多样化的衣壳洗牌文库。第一步，生成条形码质粒文库，并将洗牌衣壳基因文库克隆到其中。然后，MiSeq（短读长，高读深）和PacBio（长读长，低读深）NGS以及Sanger测序的组合用于生成他们的LUT21。2019年，Ogden和来自ChurchLab 22 的同事使用在每个位置都有单点突变、插入和缺失的文库描绘了AAV2衣壳对多种功能的适应性，最终实现了机器引导设计。为了生成文库，合成衣壳基因的较小片段，用条形码标记，进行下一代测序，然后克隆到完整的衣壳基因中。NGS数据用于生成LUT。然后仅使用条形码和短读取序列对库进行筛选，这反过来又允许更高的读取深度22。
条形码文库主要用于筛选已知、天然和工程变体的池，经过几轮衣壳文库的选择或独立于衣壳进化研究。这种文库的优点是有机会筛选多个衣壳，同时减少动物数量并最大限度地减少动物之间的变异。将这项技术引入AAV领域的第一批研究是在大约十年前发表的。Nakai实验室12用一对12 核苷酸条形码标记了191个双丙氨酸突变体，覆盖AAV9的VP1上的氨基酸356至736。使用NGS，在 体内筛选 文库的半乳糖结合和其他性质12。Marsic及其同事在1年后使用双条带分析描绘了AAV变体的生物分布13。最近一项针对非人灵长类动物的研究比较了使用不同递送途径的29个衣壳在中枢神经系统中的生物分布23。我们的实验室最近发布了183种变体的条形码AAV库屏幕，其中包括天然和工程AAV。DNA和RNA水平上的这些筛选导致在小鼠中鉴定出高度肌致性AAV变体24以及在小鼠大脑中显示出高细胞类型特异性的其他变体25。
在这里，我们描述了这项工作中使用的方法，并对其进行了扩展，以包括AAV肽显示文库的筛选。这包括生成AAV2肽显示文库，用于定量的数字液滴PCR（dd-PCR）方法，最后是用于分析AAV变体的NGS管道，部分基于Weinmann及其同事的工作24。最后，提供了条形码AAV文库的生成和同一出版物中使用的NGS管道的描述。
Protocol
Representative Results
Discussion
在该协议中，概述了肽显示AAV衣壳工程和条形码AAV文库筛选以及文库组成和衣壳性能的生物信息学分析所需的步骤。该协议侧重于促进这些类型文库的生物信息学分析的步骤，因为大多数病毒学实验室在编程技能方面落后，以匹配他们在分子生物学技术方面的熟练程度。正如引言中所述，这两种类型的库在文献中都有广泛的描述，并且可以相对容易地复制。
作为第一步，概?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G.非常感谢德国研究基金会（DFG）通过DFG合作研究中心SFB1129（Projektnummer 240245660）和TRR179（Projektnummer 272983813）以及德国感染研究中心（DZIF，BMBF;TTU-艾滋病毒 04.819）。
Materials
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
References
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