Generering af AAV-peptiddisplaybibliotek og efterfølgende validering gennem stregkode af kandidater med nye egenskaber til oprettelse af næste generations AAV’er.
Genleveringsvektorer afledt af adenoassocieret virus (AAV) er et af de mest lovende værktøjer til behandling af genetiske sygdomme, hvilket fremgår af tilskyndelse til kliniske data og godkendelse af flere AAV-genterapier. To hovedårsager til AAV-vektorers succes er (i) den forudgående isolering af forskellige naturligt forekommende virale serotyper med forskellige egenskaber og (ii) den efterfølgende etablering af kraftfulde teknologier til deres molekylære teknik og genanvendelse i høj gennemstrømning. Yderligere styrkelse af potentialet i disse teknikker er nyligt implementerede strategier til stregkodning af udvalgte AAV-kapsider på DNA- og RNA-niveau, hvilket muliggør deres omfattende og parallelle in vivo-stratificering i alle større organer og celletyper i et enkelt dyr. Her præsenterer vi en grundlæggende pipeline, der omfatter dette sæt komplementære veje, ved hjælp af AAV-peptiddisplay til at repræsentere det mangfoldige arsenal af tilgængelige capsid-tekniske teknologier. Derfor beskriver vi først de afgørende trin for genereringen af et AAV-peptiddisplaybibliotek til in vivo-udvælgelse af kandidater med ønskede egenskaber, efterfulgt af en demonstration af, hvordan man stregkoder de mest interessante capsid-varianter til sekundær in vivo-screening. Dernæst eksemplificerer vi metoden til oprettelse af biblioteker til næste generations sekventering (NGS), herunder stregkodeforstærkning og adapterligering, inden vi slutter med en oversigt over de mest kritiske trin under NGS-dataanalyse. Da de protokoller, der rapporteres her, er alsidige og tilpasningsdygtige, kan forskere let udnytte dem til at berige de optimale AAV-capsidvarianter i deres foretrukne sygdomsmodel og til genterapiapplikationer.
Genoverførselsterapi er introduktion af genetisk materiale i celler for at reparere, erstatte eller ændre det cellulære genetiske materiale for at forebygge, behandle, helbrede eller forbedre sygdom. Genoverførsel, både in vivo og ex vivo, er afhængig af forskellige leveringssystemer, ikke-virale og virale. Virus har udviklet sig naturligt til effektivt at transducere deres målceller og kan bruges som leveringsvektorer. Blandt de forskellige typer virale vektorer, der anvendes i genterapi, er adenoassocierede vira i stigende grad blevet anvendt på grund af deres manglende patogenicitet, sikkerhed, lave immunogenicitet og vigtigst af alt deres evne til at opretholde langsigtet, ikke-integrerende ekspression 1,2,3. AAV-genterapi har givet betydelige resultater i løbet af det sidste årti; tre behandlinger er blevet godkendt af Det Europæiske Lægemiddelagentur og US Food and Drug Administration til brug hos mennesker 3,4. Flere kliniske forsøg er også i gang til behandling af en række sygdomme, såsom hæmofili, muskel-, hjerte- og neurologiske sygdomme, som gennemgået andetsteds3. På trods af årtiers fremskridt har området for genterapi oplevet en række tilbageslag i de senere år4, vigtigst dødsfald i kliniske forsøg5, der er blevet sat i bero på grund af dosisbegrænsende toksiciteter, især for væv, der er massive, såsom muskler eller vanskelige at nå, såsom hjerne6.
AAV-vektorerne, der i øjeblikket anvendes i kliniske forsøg, tilhører de naturlige serotyper med nogle få undtagelser: 1. AAV-teknik giver mulighed for at udvikle vektorer med overlegen organ- eller cellespecificitet og effektivitet. I de sidste to årtier er flere tilgange blevet anvendt med succes, såsom peptidvisning, loop-swap, capsid-DNA-blanding, fejlbehæftet PCR og målrettet design til at generere individuelle AAV-varianter eller biblioteker deraf med forskellige egenskaber7. Disse udsættes derefter for flere runder af rettet evolution for at vælge varianterne i dem med de ønskede egenskaber, som gennemgået andetsteds 1,3. Af alle capsid-evolutionsstrategierne har peptiddisplay AAV-biblioteker været de mest anvendte på grund af nogle unikke egenskaber: de er relativt lette at generere, og de kan opnå høj mangfoldighed og high-throughput sekventering, hvilket gør det muligt at spore deres udvikling.
De første vellykkede AAV-biblioteker til peptidindsættelse blev beskrevet for næsten 20 år siden. I en af de første konstruerede Perabo et al.8 et bibliotek af modificerede AAV2-kapsider, hvor en pulje af tilfældigt genererede oligonukleotider blev indsat i et plasmid i en position, der svarer til aminosyre 587 af VP1-capsidproteinet i den tredobbelte akse, der stikker ud fra kapsiden. Ved hjælp af adenovirus-co-infektion blev AAV-biblioteket udviklet gennem flere udvælgelsesrunder, og de endelige re-målrettede varianter viste sig at være i stand til at transducere cellelinjer, der var ildfaste over for forældrenes AAV28. Kort tid efter introducerede Müller et al.9 totrinssystemet til biblioteksproduktion, en betydelig forbedring af protokollen. Indledningsvis bruges plasmidbiblioteket sammen med et adenoviralt hjælperplasmid til at producere et AAV-bibliotek, der indeholder kimære kapsider. Dette AAV-shuttlebibliotek bruges til at inficere celler ved lav infektionsmultiplicitet (MOI) med det formål at introducere et viralt genom pr. Celle. Co-infektion med adenovirus sikrer produktion af AAV’er med et matchende genom og kapsid9. Omkring et årti senere brugte Dalkara10 in vivo-styret evolution til at skabe 7m8-varianten. Denne variant har en 10 aminosyreindsættelse (LALGETTRPA), hvoraf tre fungerer som linkere, og effektivt retter sig mod den ydre nethinden efter intravitreal injektion10. Dette konstruerede capsid er en enestående succeshistorie, da det er en af de få konstruerede kapsider, der hidtil har nået klinikken11.
Feltet oplevede et andet løft med introduktionen af næste generations sekventeringsteknikker (NGS). To publikationer fra Adachi et al.12 i 2014 og fra Marsic et al.13 i 2015 viste NGS’s magt til at spore distributionen af stregkodede AAV capsid-biblioteker med høj nøjagtighed. Et par år senere blev NGS af stregkodede regioner tilpasset peptidindsættelsesregionen for at følge kapsidudviklingen. Körbelin et al.14 udførte en NGS-guidet screening for at identificere et lungemålrettet AAV2-baseret kapsid. NGS-analysen hjalp med at beregne tre ratingscorer: berigelsesscoren mellem udvælgelsesrunder, den generelle specificitetsscore for at bestemme vævsspecificitet og endelig den kombinerede score14. Gradinaru lab15 offentliggjorde det Cre-rekombinationsbaserede AAV målrettede evolution (CREATE) system i samme år, hvilket letter en celletype-specifik udvælgelse. I dette system bærer capsidbiblioteket en Cre-invertibel switch, da polyA-signalet flankeres af to loxP-steder. AAV-biblioteket injiceres derefter i Cre-mus, hvor polyA-signalet kun inverteres i Cre+-celler, hvilket giver skabelonen til binding af en omvendt PCR-primer med den fremadgående primer i capsid-genet. Denne meget specifikke PCR-redning gjorde det muligt at identificere AAV-PHP. B-variant, der kan krydse blod-hjerne-barrieren15. Dette system blev videreudviklet til M-CREATE (Multiplexed-CREATE), hvor NGS og syntetisk biblioteksgenerering blev integreret i pipelinen16.
En forbedret RNA-baseret version af dette system fra Maguire lab17, iTransduce, tillader selektion på DNA-niveau af kapsider, der funktionelt transducerer celler og udtrykker deres genomer. Det virale genom i peptiddisplaybiblioteket omfatter et Cre-gen under kontrol af en allestedsnærværende promotor og capsid-genet under kontrol af p41-promotoren. Biblioteket injiceres i mus, der har en loxP-STOP-loxP-kassette opstrøms for tdTomato. Celler transduceret med AAV-varianter, der udtrykker det virale genom og derfor Cre udtrykker tdTomat og i kombination med cellemarkører kan sorteres og vælges17. Tilsvarende placerede Nonnenmacher et al.18 og Tabebordbar et al.19 capsid-genbiblioteket under kontrol af vævsspecifikke promotorer. Efter injektion i forskellige dyremodeller blev viralt RNA anvendt til at isolere kapsidvarianterne.
En alternativ tilgang er at bruge stregkoder til at mærke capsidbiblioteker. Björklund lab20 brugte denne tilgang til stregkodepeptidindsættelseskapsidbiblioteker og udviklede den stregkodede rationelle AAV-vektorevolution (BRAVE). I et plasmid klones Rep2Cap-kassetten ved siden af et inverteret terminalgentagelser (ITR) -flankeret, gult fluorescerende protein (YFP) -udtrykkende, stregkodemærket transgen. Ved hjælp af loxP-steder mellem enden af hætten og begyndelsen af stregkoden genererer en in vitro Cre-rekombination et fragment, der er lille nok til NGS, hvilket muliggør associering af peptidindsættelse med den unikke stregkode (opslagstabel, LUT). AAV-produktion udføres ved hjælp af plasmidbiblioteket, og stregkoderne udtrykt i mRNA’et screenes efter in vivo-applikation , igen med NGS20. Når capsidbibliotekerne omfatter varianter af hele capsid-genet (dvs. blandede biblioteker), skal der anvendes langlæst sekventering. Flere grupper har brugt stregkoder til at tagge disse forskellige biblioteker, hvilket muliggør NGS med højere læsedybde. Kay-laboratoriet21 mærkede meget forskellige capsid-blandede biblioteker med stregkoder nedstrøms for cap polyA-signalet. I et første trin blev der genereret et stregkodet plasmidbibliotek, og det blandede capsid-genbibliotek blev klonet ind i det. Derefter blev en kombination af MiSeq (kort læsning, højere læsedybde) og PacBio (lang læsning, lavere læsedybde) NGS samt Sanger-sekventering brugt til at generere deres LUT21. I 2019 afgrænsede Ogden og kolleger fra Kirkens laboratorium22 AAV2-kapsidegnetheden til flere funktioner ved hjælp af biblioteker, der havde enkeltpunktsmutationer, indsættelser og sletninger i hver position, hvilket i sidste ende muliggjorde maskinstyret design. Til generering af biblioteket blev mindre fragmenter af capsid-genet syntetiseret, mærket med en stregkode, næste generations sekventeret og derefter klonet ind i det fulde capsid-gen. NGS-dataene blev brugt til at generere en LUT. Biblioteket blev derefter screenet ved hjælp af kun stregkoder og kortlæsningsekventering, hvilket igen tillader højere læsedybde22.
Stregkodede biblioteker er overvejende blevet brugt til at screene en pulje af kendte, naturlige og konstruerede varianter efter flere runder med udvælgelse af capsidbiblioteker eller uafhængigt af en capsid-evolutionsundersøgelse. Fordelen ved sådanne biblioteker er muligheden for at screene flere kapsider, samtidig med at antallet af dyr reduceres og variationen mellem dyr minimeres. De første undersøgelser, der introducerede denne teknologi til AAV-feltet, blev offentliggjort for næsten et årti siden. Nakai lab 12 mærkede 191 dobbelte alaninmutanter, der dækker aminosyrerne 356 til 736 på VP1 fra AAV9 med et par 12-nukleotidstregkoder. Ved hjælp af NGS blev biblioteket screenet in vivo for galactosebinding og andre egenskaber12. Marsic og kolleger afgrænsede biodistributionen af AAV-varianter ved hjælp af også en dobbelt-barcorded analyse 1 år senere13. En nyere undersøgelse af ikke-menneskelige primater sammenlignede biofordelingen i centralnervesystemet af 29 kapsider ved hjælp af forskellige leveringsveje23. Vores laboratorium har for nylig offentliggjort stregkodede AAV-biblioteksskærme med 183 varianter, der omfattede naturlige og konstruerede AAV’er. Disse screeninger på DNA- og RNA-niveau førte til identifikation af en meget myotrop AAV-variant24 hos mus såvel som andre, der viste en høj celletypespecificitet i musehjernen25.
Her beskriver vi den metode, der anvendes i dette arbejde, og udvider den til at omfatte screening af AAV-peptiddisplaybiblioteker. Dette omfatter generering af AAV2-peptiddisplaybiblioteker, en digital dråbe-PCR (dd-PCR) metode til kvantificering og endelig en NGS-pipeline til analyse af AAV-varianterne, delvist baseret på Weinmanns og kollegers arbejde24. Endelig gives en beskrivelse af genereringen af stregkodede AAV-biblioteker og NGS-pipelinen, der anvendes i samme publikation.
I denne protokol er de trin, der er nødvendige for peptidvisning AAV capsid engineering og for stregkodet AAV bibliotek screening, samt for bioinformatisk analyse af bibliotekets sammensætning og capsid ydeevne, skitseres. Denne protokol fokuserer på de trin, der letter bioinformatisk analyse af disse typer biblioteker, fordi de fleste virologilaboratorier halter i programmeringsfærdigheder for at matche deres færdigheder i molekylærbiologiske teknikker. Begge typer biblioteker er blevet grundigt beskrevet i litter…
The authors have nothing to disclose.
D.G. sætter stor pris på støtte fra German Research Foundation (DFG) gennem DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) og TRR179 (Projektnummer 272983813) samt fra det tyske center for infektionsforskning (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).
Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |