Isolement de vecteurs de thérapie génique de nouvelle génération par l’ingénierie, le codage à barres et le criblage de variantes de capside du virus adéno-associé (AAV)
Summary
Génération de bibliothèque d’affichage de peptides AAV et validation ultérieure par le codage à barres de candidats ayant de nouvelles propriétés pour la création d’AAV de nouvelle génération.
Abstract
Les vecteurs de livraison de gènes dérivés du virus adéno-associé (AAV) sont l’un des outils les plus prometteurs pour le traitement des maladies génétiques, comme en témoignent les données cliniques encourageantes et l’approbation de plusieurs thérapies géniques AAV. Deux raisons majeures du succès des vecteurs AAV sont (i) l’isolement préalable de divers sérotypes viraux naturels ayant des propriétés distinctes, et (ii) la mise en place ultérieure de technologies puissantes pour leur ingénierie moléculaire et leur réutilisation à haut débit. Le potentiel de ces techniques est récemment mis en œuvre pour coder à barres des capsides AAV sélectionnées au niveau de l’ADN et de l’ARN, permettant leur stratification in vivo complète et parallèle dans tous les principaux organes et types de cellules d’un seul animal. Ici, nous présentons un pipeline de base englobant cet ensemble de voies complémentaires, en utilisant l’affichage peptidique AAV pour représenter l’arsenal diversifié de technologies d’ingénierie de capside disponibles. En conséquence, nous décrivons d’abord les étapes cruciales de la génération d’une bibliothèque d’affichage de peptides AAV pour la sélection in vivo de candidats ayant les propriétés souhaitées, suivie d’une démonstration de la façon de coder à barres les variantes de capside les plus intéressantes pour le criblage secondaire in vivo. Ensuite, nous illustrons la méthodologie de création de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération (NGS), y compris l’amplification de codes-barres et la ligature d’adaptateurs, avant de conclure par un aperçu des étapes les plus critiques de l’analyse des données NGS. Comme les protocoles rapportés ici sont polyvalents et adaptables, les chercheurs peuvent facilement les exploiter pour enrichir les variantes optimales de capside AAV dans leur modèle de maladie préféré et pour des applications de thérapie génique.
Introduction
La thérapie par transfert de gènes est l’introduction de matériel génétique dans les cellules pour réparer, remplacer ou modifier le matériel génétique cellulaire afin de prévenir, traiter, guérir ou améliorer la maladie. Le transfert de gènes, à la fois in vivo et ex vivo, repose sur différents systèmes d’administration, non viraux et viraux. Les virus ont évolué naturellement pour transduire efficacement leurs cellules cibles et peuvent être utilisés comme vecteurs de livraison. Parmi les différents types de vecteurs viraux utilisés en thérapie génique, les virus adéno-associés ont été de plus en plus utilisés, en raison de leur absence de pathogénicité, de leur innocuité, de leur faible immunogénicité et, surtout, de leur capacité à maintenir une expression non intégratrice à long terme 1,2,3. La thérapie génique AAV a donné lieu à des réalisations considérables au cours de la dernière décennie; trois thérapies ont été approuvées par l’Agence européenne des médicaments et la Food and Drug Administration des États-Unis pour une utilisation chez l’homme 3,4. Plusieurs essais cliniques sont également en cours pour traiter diverses maladies, comme l’hémophilie, les maladies musculaires, cardiaques et neurologiques, comme on l’a vu ailleurs3. Malgré des décennies de progrès, le domaine de la thérapie génique a connu une série de revers ces dernières années4, surtout des décès dans les essais cliniques5 qui ont été suspendus en raison de toxicités limitant la dose, en particulier pour les tissus massifs, tels que les muscles, ou difficiles à atteindre, tels que le cerveau6.
Les vecteurs AAV actuellement utilisés dans les essais cliniques appartiennent aux sérotypes naturels à quelques exceptionsprès 1. L’ingénierie AAV offre la possibilité de développer des vecteurs avec une spécificité et une efficacité supérieures pour les organes ou les cellules. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs approches ont été appliquées avec succès, telles que l’affichage peptidique, l’échange de boucles, le brassage de l’ADN de la capside, la PCR sujette aux erreurs et la conception ciblée, pour générer des variantes AAV individuelles ou des bibliothèques de celles-ci avec diverses propriétés7. Ceux-ci sont ensuite soumis à de multiples cycles d’évolution dirigée pour sélectionner les variantes en leur sein avec les propriétés souhaitées, comme examiné ailleurs 1,3. De toutes les stratégies d’évolution de la capside, les bibliothèques AAV d’affichage peptidique ont été les plus largement utilisées, en raison de certaines propriétés uniques: elles sont relativement faciles à générer et peuvent atteindre une grande diversité et un séquençage à haut débit, ce qui permet de suivre leur évolution.
Les premières bibliothèques AAV d’insertion de peptides réussies ont été décrites il y a près de 20 ans. Dans l’un des premiers, Perabo et al.8 ont construit une bibliothèque de capsides AAV2 modifiées, dans laquelle un pool d’oligonucléotides générés aléatoirement a été inséré dans un plasmide à une position qui correspond à l’acide aminé 587 de la protéine de capside VP1, dans le triple axe dépassant de la capside. En utilisant la co-infection par l’adénovirus, la bibliothèque AAV a été développée à travers plusieurs cycles de sélection, et les variantes finales reciblées se sont révélées capables de transduire des lignées cellulaires réfractaires à l’AAV2parental 8. Peu de temps après, Müller et al.9 ont introduit le système en deux étapes pour la production en bibliothèque, une amélioration significative du protocole. Initialement, la bibliothèque plasmidique, ainsi qu’un plasmide auxiliaire adénoviral, sont utilisés pour produire une bibliothèque AAV qui contient des capsides chimériques. Cette bibliothèque de navettes AAV est utilisée pour infecter des cellules à faible multiplicité d’infection (MOI), dans le but d’introduire un génome viral par cellule. La co-infection par l’adénovirus assure la production d’AAV avec un génome et une capside9 correspondants. Environ une décennie plus tard, Dalkara10 a utilisé l’évolution dirigée in vivo pour créer la variante 7m8. Cette variante a une insertion de 10 acides aminés (LALGETTRPA), dont trois agissent comme des agents de liaison, et cible efficacement la rétine externe après injection intravitréenne10. Cette capside artificielle est une réussite exceptionnelle, car c’est l’une des rares capsides modifiées à se rendre à la clinique jusqu’àprésent11.
Le domaine a connu un deuxième coup de pouce avec l’introduction de techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS). Deux publications d’Adachi et al.12 en 2014 et de Marsic et al.13 en 2015, ont montré la puissance du NGS pour suivre la distribution des bibliothèques de capsides AAV à code-barres avec une grande précision. Quelques années plus tard, le NGS des régions à code-barres a été adapté à la région d’insertion peptidique pour suivre l’évolution de la capside. Körbelin et coll.14 ont effectué un dépistage guidé par NGS pour identifier une capside pulmonaire ciblée basée sur AAV2. L’analyse NGS a permis de calculer trois scores de notation : le score d’enrichissement entre les tours de sélection, le score de spécificité générale pour déterminer la spécificité tissulaire, et enfin le score combiné14. Le laboratoire Gradinaru15 a publié le système d’évolution ciblée AAV basé sur la recombinaison Cre (CREATE) la même année, qui facilite une sélection spécifique au type cellulaire. Dans ce système, la bibliothèque de capsides porte un commutateur Cre-inversible, car le signal polyA est flanqué de deux sites loxP. La bibliothèque AAV est ensuite injectée chez les souris Cre, où le signal polyA est inversé uniquement dans les cellules Cre+, fournissant le modèle pour la liaison d’une amorce de PCR inverse avec l’amorce directe dans le gène de la capside. Ce sauvetage PCR très spécifique a permis l’identification de l’AAV-PHP. Variante B qui peut traverser la barrière hémato-encéphalique15. Ce système a ensuite évolué pour devenir M-CREATE (Multiplexed-CREATE), dans lequel NGS et la génération de bibliothèques synthétiques ont été intégrées dans le pipeline16.
Une version améliorée à base d’ARN de ce système du laboratoire Maguire17, iTransduce, permet de sélectionner au niveau de l’ADN des capsides qui transduisent fonctionnellement les cellules et expriment leurs génomes. Le génome viral de la bibliothèque d’affichage peptidique comprend un gène Cre sous le contrôle d’un promoteur ubiquitaire et le gène de la capside sous le contrôle du promoteur p41. La bibliothèque est injectée chez des souris qui ont une cassette loxP-STOP-loxP en amont de tdTomato. Les cellules transduites avec des variantes AAV qui expriment le génome viral et donc Cre expriment tdTomato et, en combinaison avec des marqueurs cellulaires, peuvent être triées et sélectionnées17. De même, Nonnenmacher et al.18 et Tabebordbar et al.19 ont placé la bibliothèque de gènes de la capside sous le contrôle de promoteurs spécifiques aux tissus. Après injection dans différents modèles animaux, l’ARN viral a été utilisé pour isoler les variantes de capside.
Une autre approche consiste à utiliser le code-barres pour baliser les bibliothèques de capsides. Le laboratoire Björklund20 a utilisé cette approche pour les bibliothèques de capsides d’insertion de peptides à code-barres et a développé l’évolution rationnelle du vecteur AAV à code-barres (BRAVE). Dans un plasmide, la cassette Rep2Cap est clonée à côté d’un transgène à code-barres à répétitions terminales inversées (ITR) exprimant une protéine fluorescente jaune (YFP). En utilisant des sites loxP entre la fin du bouchon et le début du code-barres, une recombinaison Cre in vitro génère un fragment suffisamment petit pour le NGS, permettant ainsi l’association de l’insertion peptidique avec le code-barres unique (table de consultation, LUT). La production d’AAV est réalisée à l’aide de la bibliothèque plasmidique et les codes-barres exprimés dans l’ARNm sont criblés après application in vivo , toujours avec NGS20. Lorsque les bibliothèques de capsides comprennent des variantes de l’ensemble du gène de la capside (c.-à-d. bibliothèques mélangées), le séquençage à lecture longue doit être utilisé. Plusieurs groupes ont utilisé des codes-barres pour étiqueter ces diverses bibliothèques, ce qui permet à NGS d’avoir une profondeur de lecture plus élevée. Le laboratoire Kay21 a étiqueté des bibliothèques mélangées de capsides très diverses avec des codes-barres en aval du signal polyA du capuchon . Dans un premier temps, une bibliothèque de plasmides à code-barres a été générée et la bibliothèque de gènes de capside mélangée y a été clonée. Ensuite, une combinaison de MiSeq (lecture courte, profondeur de lecture plus élevée) et PacBio (lecture longue, profondeur de lecture inférieure) NGS ainsi que le séquençage Sanger a été utilisée pour générer leur LUT21. En 2019, Ogden et ses collègues du laboratoireChurch 22 ont délimité l’aptitude de la capside AAV2 à plusieurs fonctions à l’aide de bibliothèques comportant des mutations, des insertions et des suppressions ponctuelles dans chaque position, ce qui a finalement permis une conception guidée par machine. Pour la génération de la bibliothèque, des fragments plus petits du gène de la capside ont été synthétisés, marqués avec un code-barres, séquencés de nouvelle génération, puis clonés dans le gène complet de la capside. Les données NGS ont été utilisées pour générer une LUT. La bibliothèque a ensuite été examinée à l’aide uniquement des codes-barres et du séquençage de lecture courte, ce qui permet une profondeur de lecture plus élevée22.
Les bibliothèques à code-barres ont été principalement utilisées pour examiner un pool de variantes connues, naturelles et artificielles après plusieurs cycles de sélection de bibliothèques de capsides ou indépendamment d’une étude de l’évolution de la capside. L’avantage de ces bibliothèques est la possibilité de cribler plusieurs capsides, tout en réduisant le nombre d’animaux et en minimisant les variations entre les animaux. Les premières études qui ont introduit cette technologie dans le domaine de l’AAV ont été publiées il y a près de dix ans. Le laboratoire Nakai 12 a marqué 191 mutants doubles alanine couvrant les acides aminés 356 à 736 sur le VP1 de AAV9 avec une paire de codes-barres12 nucléotides. À l’aide de NGS, la bibliothèque a été examinée in vivo pour la liaison au galactose et d’autres propriétés12. Marsic et ses collègues ont délimité la biodistribution des variantes AAV en utilisant également une analyse à double barcordée 1 an plus tard13. Une étude plus récente chez des primates non humains a comparé la biodistribution dans le système nerveux central de 29 capsides en utilisant différentes voies d’administration23. Notre laboratoire a récemment publié des criblages de bibliothèque AAV à code-barres de 183 variantes comprenant des AAV naturels et artificiels. Ces criblages au niveau de l’ADN et de l’ARN ont conduit à l’identification d’une variante AAV24 hautement myotrope chez la souris ainsi que d’autres présentant une spécificité de type cellulaire élevée dans le cerveau de souris25.
Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée dans ce travail et l’élargissons pour inclure le criblage des bibliothèques d’affichage de peptides AAV. Cela comprend la génération de bibliothèques d’affichage de peptides AAV2, une méthode de PCR numérique par gouttelettes (dd-PCR) pour la quantification, et enfin un pipeline NGS pour analyser les variantes AAV, basé en partie sur les travaux de Weinmann et ses collègues24. Enfin, une description de la génération de bibliothèques AAV à code-barres et du pipeline NGS utilisé dans la même publication est fournie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, les étapes nécessaires à l’ingénierie de la capside AAV d’affichage peptidique et au criblage de bibliothèques AAV à code-barres, ainsi qu’à l’analyse bioinformatique de la composition de la bibliothèque et des performances de la capside, sont décrites. Ce protocole se concentre sur les étapes qui facilitent l’analyse bioinformatique de ces types de bibliothèques, car la plupart des laboratoires de virologie accusent un retard dans les compétences en programmation correspondant à…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.G. apprécie grandement le soutien de la Fondation allemande pour la recherche (DFG) par l’intermédiaire des centres de recherche collaborative DFG SFB1129 (Projektnummer 240245660) et TRR179 (Projektnummer 272983813), ainsi que du Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF, BMBF; TTU-VIH 04.819).
Materials
| Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
| Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
| BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
| BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
| β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
| BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
| dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
| DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
| Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
| E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
| Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
| GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
| Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
| ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
| ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
| Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
| MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
| NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
| NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
| NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
| NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
| Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
| PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
| Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
| Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
| ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
| Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
| Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
| pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
| QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
| Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
| Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
| QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
| rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
| rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
| rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
| SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
| 5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
| TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
| T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
| TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
| YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
| YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
| YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
| Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |
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