AAV peptid display bibliotek generering og påfølgende validering gjennom strekkoding av kandidater med nye egenskaper for etablering av neste generasjons AAVs.
Genleveringsvektorer avledet fra adenoassosiert virus (AAV) er et av de mest lovende verktøyene for behandling av genetiske sykdommer, dokumentert ved oppmuntrende kliniske data og godkjenning av flere AAV-genterapier. To hovedårsaker til suksessen til AAV-vektorer er (i) den tidligere isoleringen av forskjellige naturlig forekommende virale serotyper med distinkte egenskaper, og (ii) den påfølgende etableringen av kraftige teknologier for molekylærteknikk og gjenbruk i høy gjennomstrømning. Ytterligere å øke potensialet i disse teknikkene er nylig implementerte strategier for strekkoding av utvalgte AAV-kapsider på DNA- og RNA-nivå, noe som muliggjør deres omfattende og parallelle in vivo-stratifisering i alle større organer og celletyper i et enkelt dyr. Her presenterer vi en grunnleggende pipeline som omfatter dette settet av komplementære veier, ved hjelp av AAV-peptidskjerm for å representere det mangfoldige arsenalet av tilgjengelige capsid engineering-teknologier. Følgelig beskriver vi først de sentrale trinnene for generering av et AAV-peptiddisplaybibliotek for in vivo-utvelgelse av kandidater med ønskede egenskaper, etterfulgt av en demonstrasjon av strekkode for de mest interessante kapsidvariantene for sekundær in vivo-screening. Deretter eksemplifiserer vi metodikken for opprettelse av biblioteker for neste generasjons sekvensering (NGS), inkludert strekkodeforsterkning og adapterligering, før vi avslutter med en oversikt over de mest kritiske trinnene under NGS-dataanalyse. Siden protokollene som er rapportert her er allsidige og tilpasningsdyktige, kan forskere enkelt utnytte dem til å berike de optimale AAV-kapsidvariantene i deres favorittsykdomsmodell og for genterapiapplikasjoner.
Genoverføringsterapi er innføring av genetisk materiale i celler for å reparere, erstatte eller endre det cellulære genetiske materialet for å forebygge, behandle, kurere eller forbedre sykdom. Genoverføring, både in vivo og ex vivo, er avhengig av forskjellige leveringssystemer, ikke-virale og virale. Virus har utviklet seg naturlig for effektivt å transducere sine målceller og kan brukes som leveringsvektorer. Blant de forskjellige typer virale vektorer som brukes i genterapi, har adenoassosierte virus blitt brukt i økende grad på grunn av deres mangel på patogenisitet, sikkerhet, lav immunogenisitet og viktigst av alt deres evne til å opprettholde langsiktig, ikke-integrerende uttrykk 1,2,3. AAV-genterapi har gitt betydelige prestasjoner det siste tiåret; tre behandlinger er godkjent av European Medicines Agency og US Food and Drug Administration for bruk hos mennesker 3,4. Flere kliniske studier pågår også for å behandle en rekke sykdommer, som hemofili, muskel-, hjerte- og nevrologiske sykdommer, som gjennomgått andre steder3. Til tross for flere tiår med fremskritt har genterapifeltet opplevd en rekke tilbakeslag de siste årene4, viktigst dødsfall i kliniske studier5 som har blitt satt på vent på grunn av dosebegrensende toksisiteter, spesielt for vev som er massive, for eksempel muskler eller vanskelig å nå, for eksempel hjerne6.
AAV-vektorene som i dag brukes i kliniske studier, tilhører de naturlige serotypene, med noen få unntak:1. AAV-engineering tilbyr muligheten til å utvikle vektorer med overlegen organ- eller cellespesifisitet og effektivitet. I løpet av de siste to tiårene har flere tilnærminger blitt brukt med suksess, for eksempel peptidvisning, loop-swap, kapsid-DNA-stokking, feilutsatt PCR og målrettet design, for å generere individuelle AAV-varianter eller biblioteker derav med forskjellige egenskaper7. Disse blir deretter utsatt for flere runder med rettet evolusjon for å velge variantene i dem med de ønskede egenskapene, som gjennomgått andre steder 1,3. Av alle kapsidevolusjonsstrategiene har AAV-biblioteker med peptidvisning vært de mest brukte på grunn av noen unike egenskaper: de er relativt enkle å generere, og de kan oppnå høyt mangfold og høy gjennomstrømningssekvensering, noe som gjør det mulig å følge utviklingen.
De første vellykkede AAV-bibliotekene for peptidinnsetting ble beskrevet for snart 20 år siden. I en av de første konstruerte Perabo et al.8 et bibliotek av modifiserte AAV2-kapsider, hvor en pool av tilfeldig genererte oligonukleotider ble satt inn i et plasmid i en posisjon som tilsvarer aminosyre 587 av VP1-kapsidproteinet, i den trefoldige aksen som stikker ut fra kapsiden. Ved hjelp av adenovirus-koinfeksjon ble AAV-biblioteket utviklet gjennom flere seleksjonsrunder, og de endelige remålrettede variantene viste seg å være i stand til å transdusere cellelinjer som var refraktære mot foreldrenes AAV28. Kort tid etter introduserte Müller et al.9 totrinnssystemet for bibliotekproduksjon, en betydelig forbedring av protokollen. I første omgang brukes plasmidbiblioteket, sammen med et adenoviralt hjelperplasmid, til å produsere et AAV-bibliotek som inneholder kimære kapsider. Dette AAV-skyttelbiblioteket brukes til å infisere celler ved lav infeksjonsgrad (MOI), med sikte på å introdusere ett virusgenom per celle. Koinfeksjon med adenovirus sikrer produksjon av AAVer med matchende genom og kapsid9. Omtrent et tiår senere brukte Dalkara10 in vivo-rettet evolusjon for å lage 7m8-varianten. Denne varianten har en 10 aminosyreinnsetting (LALGETTRPA), hvorav tre fungerer som linkere, og effektivt retter seg mot den ytre netthinnen etter intravitreal injeksjon10. Dette konstruerte kapsidet er en eksepsjonell suksesshistorie, da det er en av de få konstruerte kapsidene som har kommet seg til klinikken så langt11.
Feltet opplevde et nytt løft med introduksjonen av neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS). To publikasjoner fra Adachi et al.12 i 2014 og fra Marsic et al.13 i 2015, viste NGS’ evne til å spore distribusjonen av strekkodede AAV-kapsidbiblioteker med høy nøyaktighet. Noen år senere ble NGS av strekkodede regioner tilpasset peptidinnføringsområdet for å følge kapsidutviklingen. Körbelin et al.14 utførte en NGS-veiledet screening for å identifisere et lungemålrettet AAV2-basert kapsid. NGS-analysen bidro til å beregne tre vurderingspoeng: anrikningspoengsummen mellom utvalgsrunder, den generelle spesifisitetspoengsummen for å bestemme vevsspesifisitet, og til slutt den kombinerte poengsummen14. Gradinaru lab15 publiserte Cre-recombination-based AAV targeted evolution (CREATE) system samme år, som muliggjør et celletypespesifikt utvalg. I dette systemet bærer kapsidbiblioteket en Cre-inverterbar bryter, da polyA-signalet er flankert av to loxP-steder. AAV-biblioteket injiseres deretter i Cre-mus, hvor polyA-signalet kun inverteres i Cre+-celler, og gir mal for binding av en omvendt PCR-primer med fremre primer i kapsidgenet. Denne svært spesifikke PCR-redningen gjorde det mulig å identifisere AAV-PHP. B-variant som kan krysse blod-hjernebarrieren15. Dette systemet ble videreutviklet til M-CREATE (Multiplexed-CREATE), der NGS og syntetisk bibliotekgenerering ble integrert i rørledningen16.
En forbedret RNA-basert versjon av dette systemet fra Maguire lab17, iTransduce, tillater seleksjon på DNA-nivået av kapsider som funksjonelt transducerer celler og uttrykker deres genomer. Det virale genomet til peptiddisplaybiblioteket består av et Cre-gen under kontroll av en allestedsnærværende promotor og kapsidgenet under kontroll av p41-promotoren. Biblioteket injiseres i mus som har en loxP-STOP-loxP-kassett oppstrøms tdTomato. Celler transdusert med AAV-varianter som uttrykker virusgenomet og derfor Cre uttrykker tdTomato og i kombinasjon med cellemarkører kan sorteres og selekteres17. På samme måte plasserte Nonnenmacher et al.18 og Tabebordbar et al.19 kapsidgenbiblioteket under kontroll av vevsspesifikke promotorer. Etter injeksjon i forskjellige dyremodeller ble viralt RNA brukt til å isolere kapsidvariantene.
En alternativ tilnærming er å bruke strekkoding til å merke capsid-biblioteker. Björklundlab 20 brukte denne tilnærmingen til strekkode peptid innsetting capsid biblioteker og utviklet strekkode rasjonell AAV vektor evolusjon (BRAVE). I et plasmid er Rep2Cap-kassetten klonet ved siden av et invertert terminal repeats (ITR)-flankert, gult fluorescerende protein (YFP)-uttrykkende, strekkodemerket transgen. Ved å bruke loxP-steder mellom slutten av hetten og begynnelsen av strekkoden, genererer en in vitro Cre-rekombinasjon et fragment som er lite nok for NGS, og tillater dermed assosiasjonen av peptidinnsetting med den unike strekkoden (oppslagstabell, LUT). AAV-produksjonen utføres ved hjelp av plasmidbiblioteket og strekkodene uttrykt i mRNA screenes etter in vivo-applikasjon , igjen med NGS20. Når kapsidbibliotekene består av varianter av hele kapsidgenet (dvs. blandede biblioteker), må langlessekvensering brukes. Flere grupper har brukt strekkoder for å merke disse forskjellige bibliotekene, noe som muliggjør NGS med høyere lesedybde. Kay lab21 merket svært varierte capsid blandet biblioteker med strekkoder nedstrøms for cap polyA-signalet. I et første trinn ble et strekkodet plasmidbibliotek generert, og det blandede kapsidgenbiblioteket ble klonet inn i det. Deretter ble en kombinasjon av MiSeq (kort lest, høyere lesedybde) og PacBio (lang lest, lavere lesedybde) NGS samt Sanger-sekvensering brukt til å generere LUT21. I 2019 avgrenset Ogden og kolleger fra Kirkens laboratorium22 AAV2-kapsidegnetheten for flere funksjoner ved hjelp av biblioteker som hadde enkeltpunktmutasjoner, innsettinger og slettinger i hver posisjon, noe som til slutt muliggjorde maskinstyrt design. For genereringen av biblioteket ble mindre fragmenter av kapsidgenet syntetisert, merket med en strekkode, neste generasjons sekvensert og deretter klonet inn i det fulle kapsidgenet. NGS-dataene ble brukt til å generere en LUT. Biblioteket ble deretter screenet ved hjelp av bare strekkodene og kortlesingssekvenseringen, noe som igjen gir høyere lesedybde22.
Strekkodebiblioteker har hovedsakelig blitt brukt til å skjerme et basseng av kjente, naturlige og konstruerte varianter etter flere runder med utvalg av kapsidbiblioteker eller uavhengig av en kapsidevolusjonsstudie. Fordelen med slike biblioteker er muligheten til å skjerme flere kapsider, samtidig som antall dyr reduseres og variasjonen mellom dyr minimeres. De første studiene som introduserte denne teknologien på AAV-feltet ble publisert for snart ti år siden. Nakai lab 12 merket 191 doble alanin mutanter som dekker aminosyrer 356 til 736 på VP1 fra AAV9 med et par 12-nukleotid strekkoder. Ved hjelp av NGS ble biblioteket screenet in vivo for galaktosebinding og andre egenskaper12. Marsic og kolleger avgrenset biodistribusjonen av AAV-varianter ved hjelp av en dobbelt streket analyse 1 år senere13. En nyere studie på ikke-menneskelige primater sammenlignet biodistribusjonen i sentralnervesystemet av 29 kapsider ved hjelp av forskjellige leveringsveier23. Vårt laboratorium har nylig publisert strekkodede AAV-bibliotekskjermer med 183 varianter som inkluderte naturlige og konstruerte AAV-er. Disse skjermene på DNA- og RNA-nivå førte til identifisering av en svært myotrop AAV-variant24 hos mus så vel som andre som viste en høy celletypespesifisitet i musehjernen25.
Her beskriver vi metodikken som er brukt i dette arbeidet og utvider den til også å omfatte screening av AAV-peptiddisplaybiblioteker. Dette omfatter generering av AAV2 peptiddisplaybiblioteker, en digital dråpe-PCR (dd-PCR) metode for kvantifisering, og til slutt en NGS-pipeline for å analysere AAV-variantene, delvis basert på arbeidet til Weinmann og kolleger24. Til slutt gis en beskrivelse av genereringen av strekkodede AAV-biblioteker og NGS-pipelinen som brukes i samme publikasjon.
I denne protokollen skisseres trinnene som trengs for AAV-kapsidteknikk for peptidvisning og for strekkodet AAV-bibliotekscreening, samt for bioinformatisk analyse av biblioteksammensetning og kapsidytelse. Denne protokollen fokuserer på trinnene som letter bioinformatisk analyse av disse typer biblioteker, fordi de fleste virologilaboratorier henger etter i programmeringsferdigheter for å matche deres ferdigheter i molekylærbiologiske teknikker. Begge typer biblioteker har blitt omfattende beskrevet i litteraturen, s…
The authors have nothing to disclose.
D.G. setter stor pris på støtte fra den tyske forskningsstiftelsen (DFG) gjennom DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) og TRR179 (Projektnummer 272983813), samt av det tyske senteret for infeksjonsforskning (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).
Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |