Generering av AAV-peptidvisningsbibliotek och efterföljande validering genom streckkodning av kandidater med nya egenskaper för skapandet av nästa generations AAV.
Genleveransvektorer härledda från adenoassocierat virus (AAV) är ett av de mest lovande verktygen för behandling av genetiska sjukdomar, vilket framgår av uppmuntrande kliniska data och godkännande av flera AAV-genterapier. Två viktiga orsaker till AAV-vektorernas framgång är (i) den tidigare isoleringen av olika naturligt förekommande virala serotyper med distinkta egenskaper, och (ii) den efterföljande etableringen av kraftfulla tekniker för deras molekylära teknik och återanvändning i hög genomströmning. Ytterligare förstärkning av potentialen hos dessa tekniker är nyligen implementerade strategier för streckkodning av utvalda AAV-kapsider på DNA- och RNA-nivå, vilket möjliggör deras omfattande och parallella in vivo-stratifiering i alla större organ och celltyper i ett enda djur. Här presenterar vi en grundläggande pipeline som omfattar denna uppsättning kompletterande vägar, med hjälp av AAV-peptiddisplay för att representera den mångsidiga arsenalen av tillgängliga kapsidtekniktekniker. Följaktligen beskriver vi först de avgörande stegen för generering av ett AAV-peptiddisplaybibliotek för in vivo-urval av kandidater med önskade egenskaper, följt av en demonstration av hur man streckkodar de mest intressanta kapsidvarianterna för sekundär in vivo-screening. Därefter exemplifierar vi metoden för skapandet av bibliotek för nästa generations sekvensering (NGS), inklusive streckkodsförstärkning och adapterligering, innan vi avslutar med en översikt över de mest kritiska stegen under NGS-dataanalys. Eftersom protokollen som rapporteras här är mångsidiga och anpassningsbara kan forskare enkelt utnyttja dem för att berika de optimala AAV-kapsidvarianterna i sin favoritsjukdomsmodell och för genterapiapplikationer.
Genöverföringsterapi är införandet av genetiskt material i celler för att reparera, ersätta eller förändra det cellulära genetiska materialet för att förebygga, behandla, bota eller förbättra sjukdom. Genöverföring, både in vivo och ex vivo, bygger på olika leveranssystem, icke-virala och virala. Virus har utvecklats naturligt för att effektivt transducera sina målceller och kan användas som leveransvektorer. Bland de olika typerna av virala vektorer som används i genterapi har adenoassocierade virus använts alltmer på grund av deras brist på patogenicitet, säkerhet, låg immunogenicitet och viktigast av allt deras förmåga att upprätthålla långsiktigt, icke-integrerande uttryck 1,2,3. AAV-genterapi har gett betydande framsteg under det senaste decenniet; tre terapier har godkänts av Europeiska läkemedelsmyndigheten och US Food and Drug Administration för användning på människor 3,4. Flera kliniska prövningar pågår också för att behandla en mängd olika sjukdomar, såsom hemofili, muskulösa, hjärt- och neurologiska sjukdomar, som granskas någon annanstans3. Trots årtionden av framsteg har genterapiområdet upplevt en rad bakslag de senaste åren4, viktigast av allt dödsfall i kliniska prövningar5 som har lagts på is på grund av dosbegränsande toxiciteter, särskilt för vävnader som är massiva, såsom muskler, eller svåra att nå, såsom hjärna6.
AAV-vektorerna som för närvarande används i kliniska prövningar tillhör de naturliga serotyperna med några få undantag:1. AAV-teknik erbjuder möjligheten att utveckla vektorer med överlägsen organ- eller cellspecificitet och effektivitet. Under de senaste två decennierna har flera tillvägagångssätt framgångsrikt tillämpats, såsom peptiddisplay, loop-swap, kapsid-DNA-blandning, felbenägen PCR och riktad design, för att generera enskilda AAV-varianter eller bibliotek därav med olika egenskaper7. Dessa utsätts sedan för flera omgångar av riktad utveckling för att välja varianterna inom dem med önskade egenskaper, som granskas någon annanstans 1,3. Av alla kapsidutvecklingsstrategier har AAV-bibliotek för peptidvisning varit de mest använda på grund av några unika egenskaper: de är relativt lätta att generera och de kan uppnå hög mångfald och sekvensering med hög genomströmning, vilket möjliggör efterföljande utveckling.
De första framgångsrika AAV-biblioteken för peptidinsättning beskrevs för nästan 20 år sedan. I en av de första konstruerade Perabo et al.8 ett bibliotek av modifierade AAV2-kapsider, i vilka en pool av slumpmässigt genererade oligonukleotider infördes i en plasmid i en position som motsvarar aminosyra 587 av VP1-kapsidproteinet, i den trefaldiga axeln som sticker ut från kapsiden. Med hjälp av adenovirus-saminfektion utvecklades AAV-biblioteket genom flera urvalsomgångar, och de slutliga omriktade varianterna visade sig kunna transducera cellinjer som är eldfasta mot föräldra AAV28. Kort därefter introducerade Müller et al.9 tvåstegssystemet för biblioteksproduktion, en betydande förbättring av protokollet. Ursprungligen används plasmidbiblioteket, tillsammans med en adenoviral hjälparplasmid, för att producera ett AAV-bibliotek som innehåller chimära kapsider. Detta AAV-skyttelbibliotek används för att infektera celler vid låg infektionsmultiplicitet (MOI), med målet att införa ett viralt genom per cell. Saminfektion med adenovirus säkerställer produktion av AAV med ett matchande genom och kapsid9. Ungefär ett decennium senare använde Dalkara10 in vivo-riktad evolution för att skapa 7m8-varianten. Denna variant har en 10 aminosyrainsättning (LALGETTRPA), varav tre fungerar som länkar, och riktar sig effektivt mot den yttre näthinnan efter intravitreal injektion10. Denna konstruerade kapsid är en exceptionell framgångshistoria, eftersom det är en av få konstruerade kapsider som hittills har kommit till kliniken11.
Fältet upplevde ett andra uppsving med introduktionen av nästa generations sekvenseringstekniker (NGS). Två publikationer från Adachi et al.12 2014 och från Marsic et al.13 2015 visade kraften i NGS för att spåra distributionen av streckkodade AAV-kapsidbibliotek med hög noggrannhet. Några år senare anpassades NGS i streckkodade regioner till peptidinsättningsregionen för att följa kapsidutvecklingen. Körbelin et al.14 utförde en NGS-guidad screening för att identifiera en lungriktad AAV2-baserad kapsid. NGS-analysen hjälpte till att beräkna tre betygspoäng: anrikningspoängen mellan urvalsomgångar, den allmänna specificitetspoängen för att bestämma vävnadsspecificitet och slutligen den kombinerade poängen14. Gradinaru-labbet15 publicerade samma år det Cre-rekombinationsbaserade AAV-riktade evolutionssystemet (CREATE), vilket underlättar ett celltypspecifikt urval. I detta system bär kapsidbiblioteket en Cre-inverterbar switch, eftersom polyA-signalen flankeras av två loxP-platser. AAV-biblioteket injiceras sedan i Cre-möss, där polyA-signalen endast inverteras i Cre+-celler, vilket ger mallen för bindning av en omvänd PCR-primer med den framåtriktade primern i kapsidgenen. Denna mycket specifika PCR-räddning möjliggjorde identifieringen av AAV-PHP. B-variant som kan passera blod-hjärnbarriären15. Detta system utvecklades vidare till M-CREATE (Multiplexed-CREATE), där NGS och syntetisk biblioteksgenerering integrerades i pipeline16.
En förbättrad RNA-baserad version av detta system från Maguire lab17, iTransduce, möjliggör selektion på DNA-nivå av kapsider som funktionellt transducerar celler och uttrycker deras genom. Det virala genomet i peptidvisningsbiblioteket består av en Cre-gen under kontroll av en allestädes närvarande promotor och kapsidgenen under kontroll av p41-promotorn. Biblioteket injiceras i möss som har en loxP-STOP-loxP-kassett uppströms tdTomato. Celler transducerade med AAV-varianter som uttrycker virusgenomet och därför Cre uttrycker tdTomato och, i kombination med cellmarkörer, kan sorteras och väljas17. På liknande sätt placerade Nonnenmacher et al.18 och Tabebordbar et al.19 kapsidgenbiblioteket under kontroll av vävnadsspecifika promotorer. Efter injektion i olika djurmodeller användes viralt RNA för att isolera kapsidvarianterna.
Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda streckkodning för att tagga kapsidbibliotek. Björklunds labb20 använde detta tillvägagångssätt för att streckkodspeptidinsättningskapasidbibliotek och utvecklade streckkodsrationell AAV-vektorutveckling (BRAVE). I en plasmid klonas Rep2Cap-kassetten bredvid en inverterad terminal upprepar (ITR)-flankerad, gulfluorescerande protein (YFP)-uttryckande, streckkodsmärkt transgen. Med hjälp av loxP-platser mellan slutet av locket och början av streckkoden genererar en in vitro Cre-rekombination ett fragment som är tillräckligt litet för NGS, vilket möjliggör associering av peptidinsättning med den unika streckkoden (uppslagstabell, LUT). AAV-produktion utförs med hjälp av plasmidbiblioteket och streckkoderna uttryckta i mRNA screenas efter in vivo-applikation , återigen med NGS20. När kapsidbiblioteken består av varianter av hela kapsidgenen (dvs. blandade bibliotek) måste långläst sekvensering användas. Flera grupper har använt streckkoder för att tagga dessa olika bibliotek, vilket möjliggör NGS med högre läsdjup. Kay lab21 taggade mycket olika kapsidblandade bibliotek med streckkoder nedströms cap polyA-signalen. I ett första steg genererades ett streckkodat plasmidbibliotek och det blandade kapsidgenbiblioteket klonades in i det. Sedan användes en kombination av MiSeq (kortläsning, högre läsdjup) och PacBio (långläsning, lägre läsdjup) NGS samt Sanger-sekvensering för att generera deras LUT21. År 2019 avgränsade Ogden och kollegor från kyrkans labb22 AAV2-kapsidens lämplighet för flera funktioner med hjälp av bibliotek som hade enpunktsmutationer, infogningar och borttagningar i varje position, vilket i slutändan möjliggjorde maskinstyrd design. För genereringen av biblioteket syntetiserades mindre fragment av kapsidgenen, märktes med en streckkod, nästa generations sekvenserades och klonades sedan till hela kapsidgenen. NGS-data användes för att generera en LUT. Biblioteket screenades sedan med bara streckkoderna och kortläsningssekvenseringen, vilket i sin tur möjliggör högre läsdjup22.
Streckkodsbibliotek har främst använts för att screena en pool av kända, naturliga och konstruerade varianter efter flera omgångar av urval av kapsidbibliotek eller oberoende av en kapsidutvecklingsstudie. Fördelen med sådana bibliotek är möjligheten att screena flera kapsider, samtidigt som antalet djur minskas och variationen mellan djur minimeras. De första studierna som introducerade denna teknik till AAV-fältet publicerades för nästan ett decennium sedan. Nakai lab 12 taggade 191 dubbla alaninmutanter som täcker aminosyrorna 356 till 736 på VP1 från AAV9 med ett par 12-nukleotidstreckkoder. Med hjälp av NGS screenades biblioteket in vivo för galaktosbindning och andra egenskaper12. Marsic och kollegor avgränsade biodistributionen av AAV-varianter med hjälp av en dubbelbarcordad analys 1 år senare13. En nyare studie på icke-mänskliga primater jämförde biodistributionen i centrala nervsystemet av 29 kapsider med olika leveransvägar23. Vårt labb har nyligen publicerat streckkodade AAV-biblioteksskärmar med 183 varianter som inkluderade naturliga och konstruerade AAV. Dessa skärmar på DNA- och RNA-nivå ledde till identifieringen av en mycket myotrop AAV-variant24 hos möss såväl som andra som visar en hög celltypsspecificitet i mushjärnan25.
Här beskriver vi den metod som används i detta arbete och utökar den till att omfatta screening av AAV-peptidvisningsbibliotek. Detta omfattar generering av AAV2-peptiddisplaybibliotek, en digital dropp-PCR-metod (dd-PCR) för kvantifiering och slutligen en NGS-pipeline för att analysera AAV-varianterna, delvis baserat på Weinmanns och kollegorsarbete 24. Slutligen ges en beskrivning av genereringen av streckkodade AAV-bibliotek och NGS-rörledningen som används i samma publikation.
I detta protokoll beskrivs de steg som behövs för peptidvisning av AAV-kapsidteknik och för streckkodad AAV-biblioteksscreening, samt för bioinformatisk analys av bibliotekssammansättning och kapsidprestanda. Detta protokoll fokuserar på de steg som underlättar bioinformatisk analys av dessa typer av bibliotek, eftersom de flesta virologilaboratorier släpar efter i programmeringsförmåga för att matcha deras kunskaper i molekylärbiologiska tekniker. Båda typerna av bibliotek har beskrivits utförligt i litter…
The authors have nothing to disclose.
D.G. uppskattar mycket stöd från den tyska forskningsstiftelsen (DFG) genom DFG Collaborative Research Centers SFB1129 (Projektnummer 240245660) och TRR179 (Projektnummer 272983813), liksom från det tyska centret för infektionsforskning (DZIF, BMBF; TTU-HIV 04.819).
Amplification primer | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | DNA fragment validation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | DNA fragment validation |
AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 80204 | DNA/RNA extraction |
Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | 5067-1504 | NGS Library preparation |
Agilent 2100 Bioanalyzer System | Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA) | G2938C | NGS Library preparation |
BC-seq fw: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | ATCACTCTCGGCATGGACGAGC | NGS Library preparation |
BC-seq rv: | IDT (San Joce, CA, CA, USA) | GGCTGGCAACTAGAAGGCACA | NGS Library preparation |
β-Mercaptoethanol | Millipore Sigma (Burlington, MA, USA) | 44-420-3250ML | DNA/RNA extraction |
BglI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0143 | Digestion of double-stranded insert |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1851196 | dd-PCR cycler |
dNTPS | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | N0447S | NGS Library preparation |
ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863024 | dd-PCR supermix |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863005 | dd-PCR droplet generation oil |
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864008 | dd-PCR droplet generation cartridge |
DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863051 | dd-PCR cartridge holder |
Droplet Generator DG8 Gasket | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1863009 | dd-PCR cover for cartridge |
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 12001925 | dd-PCR 96-well plate |
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells | Lucigen (Middleton, WI, USA) | 60081-1 | Electrocompetent cells |
Electroporation cuvettes, 1mm | Biozym Scientific (Oldendorf, Germany) | 748050 | Electroporation |
GAPDH primer/probe mix | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Mm00186825_cn | Taqman qPCR primer |
Genepulser Xcell | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1652660 | Electroporation |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems (Waltham, MA, USA) | 4368814 | cDNA reverse transcription |
ITR_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR primer |
ITR_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/) | dd-PCR probe |
Illumina NextSeq 500 system | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | SY-415-1001 | NGS Library sequencing |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)* | Roche AG (Basel, Switzerland) | KK2600 07958919001 | NGS sample prepration |
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | V8151 | Sample prepration for NGS library |
NanoDrop 2000 spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-2000 | Digestion of double-stranded insert |
NGS_frw | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC | NGS primer |
NGS_rev | Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA) | CGC CTT GTG TGT TGA CAT C | NGS primer |
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles) | Illumina Inc (San Diego, CA, USA) | FC-404-2005 | NGS Library sequencing |
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit | NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA) | 9092-256 | NGS Library preparation |
PX1 Plate Sealer | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814000 | dd-PCR plate sealer |
Pierceable Foil Heat Seal | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1814040 | dd-PCR sealing foil |
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F530S | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA) | 24765-1G | AAV library preparation |
ProNex Size-Selective Purification System | Promega GmbH (Madison, WI, USA) | NG2002 | Sample prepration for NGS library |
Phusion Hot Start II Polymerase | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | F549L | NGS Library preparation |
Proteinase K | Roche AG (Basel, Switzerland) | 5963117103 | DNA/RNA extraction |
pRep2Cap2_PIS | ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab | ||
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864002 | dd-PCR droplet generator |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad (Hercules, CA, USA) | 1864003 | dd-PCR droplet analysis |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28306 | Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28704 | Plasmid vector purification |
QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 12162 | Plasmid library DNA preparation |
Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 28104 | Sample prepration for NGS library |
Qubit fluorometer | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | Q32857 | NGS Library preparation |
Qubit dsDNA HS | Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA) | Q32851 | NGS Library preparation |
QuantiFast PCR Master Mix | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 1044234 | Taqman qPCR |
rep_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC | dd-PCR primer |
rep_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | CAATCACGGCGCACATGT | dd-PCR primer |
rep_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
RNase-free DNase | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 79254 | DNA/RNA extraction |
SfiI | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | R0123 | Digestion of vector |
5 mm, steel Beads | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 69989 | DNA/RNA extraction |
TRIMER-oligonucleotides | ELLA Biotech (Munich, Germany) | – | Degenerate oligonucleotide |
T4 Ligase | New England Biolabs (Ipswich, MA, USA) | M0202L | Plasmid library ligation |
TissueLyserLT | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 85600 | DNA/RNA extraction |
YFP_fw | IDT (San Joce, CA, USA) | GAGCGCACCATCTTCTTCAAG | dd-PCR primer |
YFP_rv | IDT (San Joce, CA, USA) | TGTCGCCCTCGAACTTCAC | dd-PCR primer |
YFP_probe | IDT (San Joce, CA, USA) | FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1 | dd-PCR probe |
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped) | Zymo research (Irvine, CA, USA) | D4013 | Vector and Ligation purification |