Ekstraksjon, merking og rensing av avstamningsspesifikke celler fra humane antralfollikler

Summary

Her presenterer vi protokoller for identifisering og rensing av eggstokkceller fra antralfollikler. Vi utdyper metoder for behandling av hele eggstokker for kryopreservering av kortikale strimler samtidig som vi høster intakte antralfollikler som behandles enzymatisk for å frigjøre flere follikkelboende celletyper, inkludert granulosa, theca, endotel, hematopoietiske og stromale celler.

Abstract

Aktivering, vekst, utvikling og modning av oocytter er en kompleks prosess som koordineres ikke bare mellom flere celletyper av eggstokken, men også over flere kontrollpunkter innenfor hypothalamus / hypofysen / eggstokkkretsen. Innenfor eggstokken vokser flere spesialiserte celletyper i nær tilknytning til oocytten i eggstokkfolliklene. Biologien til disse cellene har blitt godt beskrevet i senere stadier, når de lett gjenvinnes som biprodukter av assistert reproduktiv behandling. Imidlertid utføres den grundige analysen av små antralfollikler isolert direkte fra eggstokken ikke vanligvis på grunn av mangel på humant eggstokkvev og begrenset tilgang til eggstokken hos pasienter som gjennomgår assistert reproduktiv behandling.

Disse metodene for behandling av hele eggstokkene for kryopreservering av kortikale strimler med samtidig identifisering / isolering av ovariebosatte celler muliggjør høyoppløselig analyse av de tidlige stadiene av antralfollikelutvikling. Vi demonstrerer protokoller for å isolere diskrete celletyper ved å behandle antralfollikler enzymatisk og separere granulosa-, theca-, endotel-, hematopoietiske og stromale celler. Isoleringen av celler fra antralfolliklene i forskjellige størrelser og utviklingsstadier muliggjør omfattende analyse av de cellulære og molekylære mekanismene som driver follikelvekst og ovariefysiologi og gir en kilde til levedyktige celler som kan dyrkes in vitro for å rekapitulere follikelmikromiljøet.

Introduction

De primære funksjonelle elementene i den menneskelige eggstokken er folliklene, som styrer veksten og utviklingen av oocytter. Protokoller for isolering av follikulære celler er godt etablert i sammenheng med in vitro-fertilisering , men disse er bare egnet for innsamling av celler fra luteiniserte follikler ved punktet for uthenting av oocytt¹. Vi har utviklet en protokoll som muliggjør isolering av diskrete cellepopulasjoner fra antralfollikler i forskjellige utviklingsstadier som oppstår fra innfødte eggstokker eller xenotransplantert eggstokkvev². Selv om det er enighet om at bidragene fra follikkelbosatte celler til dyrking av oocytten er svært viktige, har få studier prospektivt identifisert og ekstrahert de unike fenotypiske subtypene som er tilstede i antralstadiumfollikler. En dypere forståelse av differensieringshierarkiet og signaltransduksjon mellom spesialiserte celler under de forskjellige utviklingsstadiene kan utvide vår forståelse av ovariefysiologi under homeostatiske og patologiske forhold. Videre kan diskriminering av diskrete cellulære subtyper og deres molekylære bidrag til follikelvekst / modning gi et middel til å generere ex vivo surrogater som rekonstruerer ovariefunksjonen for å fremme oocytmodning og / eller behandle endokrin dysfunksjon.

Hver unik celletype i eggstokken bidrar til follikkelens komplekse funksjon, som effektivt fungerer som et diskret miniorgan for å fremme veksten og modningen av oocytten den inneholder. Oocytten, midtpunktet i follikkelen, er direkte innhyllet av et kontinuerlig lag av granulosa-celler (GC), med theca-cellene (TC) som danner et sekundært lag av celler som kombinerer med oocytten og GCene for å komponere follikulærenheten. Selv om de er klassifisert i to grupper, inneholder GC og TC mange undertyper. GC er klassifisert i henhold til deres posisjon i follikkelen; GCer som omgir oocytten versus de som ligger ved siden av kjellermembranen, er betegnet som henholdsvis oophorous og mural GCs, og disse undertypene viser unike transkriptomiske signaturer. TCs har mange subtyper som fungerer for å gi steroidogen, metabolsk og strukturell støtte. Endotel-, perivaskulære og immunceller spiller en sentral rolle i å opprettholde normal ovariefysiologi. Ovarial stroma tjener ikke bare som et substrat for follikelvekst, men gir også sannsynligvis en kilde til forfedre som gir opphav til TCS. Dette flerlagskomplekset av cellulære subtyper i eggstokken er det som gjør det mulig å fungere som både et endokrint og et reproduktivt organ.

Dette papiret presenterer en protokoll for identifisering og rensing av granulosa, theca, stromale, endoteliske og hematopoietiske celler fra antralfollikler. Vi har brukt denne protokollen til å isolere disse eggstokkcellene og analysere dem ved hjelp av enkeltcellesekvensering, etterfulgt av spesifikk farging i follikler av forskjellige utviklingsstadier. Protokollen gir en enkel metodikk som er replikerbar og vil muliggjøre høyoppløselig analyse av både fysiologi og patologi av eggstokken.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer mus ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Weill Cornell Medicine. Alle xenotransplantasjonsforsøk med ovarievev ble utført i henhold til gjeldende retningslinjer og forskrifter. Begge eggstokkene ble isolert fra en 14 år gammel hjernedød organdonor uten tidligere radio/kjemoterapi og ingen dokumentert historie med endokrine eller reproduktive tilstander. IRB-komiteen (Institutional Review Board) i Weill Cornell Medicine godkjente innsamling av vev, og g…

Representative Results

Vi isolerte follikler fra overflaten av eggstokken og behandlet dem enzymatisk for å isolere GC-ene samt theca- og stromacellene som omgir antralhulen. Cellene ble samlet inn, og cellefraksjonene ble sortert fra antralfolliklene (diametere mellom 0,5 mm og 4 mm) med FACS til >95 % renhet (figur 1). For å merke og rense unike cellulære fraksjoner i de humane antralfolliklene, kombinerte vi enzymatisk fordøyelse med flowcytometrisk sortering. Vi har tidligere id…

Discussion

Bedre oppløsning av det cellulære mangfoldet i eggstokkfolliklene er klinisk viktig av flere grunner. Ved anvendelse av ovennevnte protokoll på isolering av de unike fenotypiske subtypene som ligger i antralstadiefollikler, bør flere faktorer vurderes. For det første er helsen og levedyktigheten til eggstokkvevet hvorfra antralfollikkelen er avledet, avgjørende for å bestemme kvaliteten på cellene og suksessen til nedstrøms applikasjoner. Dette kan optimaliseres ved å minimere det iskemiske intervallet, arbeide…

Materials

Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
– 69.64 mL of Leibovitz's L-15
– 17.66 mL of fetal bovine serum
– 3.42 g of sucrose
– 10.65 mL of DMSO
– 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss