Extraktion, märkning och rening av härstamningsspecifika celler från humana antrala folliklar
Summary
Här presenterar vi protokoll för identifiering och rening av äggstocksceller från antrala folliklar. Vi utarbetar metoder för bearbetning av hela äggstockar för kryokonservering av kortikala remsor samtidigt som vi skördar intakta antrala folliklar som behandlas enzymatiskt för att frigöra flera follikelbosatta celltyper, inklusive granulosa, theca, endotelial, hematopoietisk och stromaceller.
Abstract
Aktivering, tillväxt, utveckling och mognad av oocyter är en komplex process som samordnas inte bara mellan flera celltyper av äggstocken utan också över flera kontrollpunkter inom hypotalamus/hypofysen/äggstockskretsen. Inom äggstocken växer flera specialiserade celltyper i nära anslutning till äggcellen i äggstocksfolliklarna. Biologin hos dessa celler har beskrivits väl i senare skeden, när de lätt återvinns som biprodukter av assisterad reproduktiv behandling. Den fördjupade analysen av små antrala folliklar isolerade direkt från äggstocken utförs emellertid inte vanligtvis på grund av bristen på human äggstocksvävnad och den begränsade tillgången till äggstocken hos patienter som genomgår assisterad reproduktiv behandling.
Dessa metoder för bearbetning av hela äggstockar för kryokonservering av kortikala remsor med samtidig identifiering / isolering av äggstocksbosatta celler möjliggör högupplöst analys av de tidiga stadierna av antralfollikelutveckling. Vi demonstrerar protokoll för att isolera diskreta celltyper genom att behandla antrala folliklar enzymatiskt och separera granulosa-, theca-, endotel-, hematopoietiska och stromaceller. Isoleringen av celler från antrala folliklar i olika storlekar och utvecklingsstadier möjliggör en omfattande analys av de cellulära och molekylära mekanismer som driver follikeltillväxt och äggstocksfysiologi och ger en källa till livskraftiga celler som kan odlas in vitro för att rekapitulera follikelmikromiljön.
Introduction
De primära funktionella elementen i den mänskliga äggstocken är folliklarna, som styr tillväxten och utvecklingen av oocyter. Protokoll för isolering av follikulära celler har varit väl etablerade i samband med in vitro-fertilisering , men dessa är endast lämpliga för insamling av celler från luteiniserade folliklar vid tidpunkten för ägguttag1. Vi har utvecklat ett protokoll som möjliggör isolering av diskreta cellpopulationer från antrala folliklar i olika utvecklingsstadier som uppstår från inhemska äggstockar eller xenotransplanterad äggstocksvävnad2. Även om det finns enighet om att bidragen från follikelbosatta celler till odlingen av äggcellen är mycket viktiga, har få studier prospektivt identifierat och extraherat de unika fenotypiska subtyperna som finns i folliklar i antralstadiet. En djupare förståelse av differentieringshierarkin och signaltransduktionen mellan specialiserade celler under de olika utvecklingsstadierna kan bredda vår förståelse av äggstocksfysiologi under homeostatiska och patologiska förhållanden. Dessutom kan diskriminering av diskreta cellulära subtyper och deras molekylära bidrag till follikeltillväxt/mognad tillhandahålla ett sätt att generera ex vivo-surrogat som rekonstruerar äggstocksfunktionen för att främja äggstocksmognad och/eller behandla endokrin dysfunktion.
Varje unik celltyp inom äggstocken bidrar till follikelns komplexa funktion, som effektivt fungerar som ett diskret miniorgan för att främja tillväxten och mognaden av äggcellen den innehåller. Oocyten, follikelns mittpunkt, är direkt omsluten av ett kontinuerligt skikt av granulosaceller (GC), med theca-cellerna (TC) som bildar ett sekundärt lager av celler som kombinerar med oocyten och GC för att komponera follikelenheten. Även om de klassificeras i två grupper innehåller GC och TC många undertyper. GC klassificeras enligt deras position i follikeln; GC som omger äggcellen kontra de som ligger intill basalmembranet betecknas som oophorous respektive mural GC, och dessa subtyper visar unika transkriptomiska signaturer. TC har många subtyper som fungerar för att ge steroidogent, metaboliskt och strukturellt stöd. Endotel-, perivaskulära och immunceller spelar en central roll för att upprätthålla normal äggstocksfysiologi. Äggstocksstroma fungerar inte bara som ett substrat för follikeltillväxt utan ger sannolikt också en källa till förfäder som ger upphov till TC. Detta flerskiktade komplex av cellulära subtyper inom äggstocken är det som möjliggör dess funktion som både ett endokrint och ett reproduktionsorgan.
Detta dokument presenterar ett protokoll för identifiering och rening av granulosa-, theca-, stromal-, endotelial- och hematopoetiska celler från antrala folliklar. Vi har använt detta protokoll för att isolera dessa äggstocksceller och analysera dem med hjälp av encellssekvensering, följt av specifik färgning i folliklar i olika utvecklingsstadier. Protokollet ger en enkel metod som är replikerbar och möjliggör högupplöst analys av både äggstockens fysiologi och patologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bättre upplösning av den cellulära mångfalden i äggstocksfolliklarna är kliniskt viktigt av flera skäl. Vid tillämpning av ovanstående protokoll på isoleringen av de unika fenotypiska subtyperna som finns inom folliklar i antralstadiet bör flera faktorer beaktas. För det första är hälsan och livskraften hos äggstocksvävnaden från vilken antralfollikeln härrör avgörande för att bestämma cellernas kvalitet och framgången för nedströmsapplikationer. Detta kan optimeras genom att minimera det ischem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stöd från Queenie Victorina Neri Research Scholar Award (DJ) och Hung-Ching Liu Research Scholar Award (LM). N.L.G stöds av NYSTEM Stem Cell and Regenerative Medicine postdoktoralt utbildningsbidrag.
Materials
| Chemicals, reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Anti-Anti |
| Antifade Mountant solution | Thermo Fisher Scientific | P36930 | ProLong Gold |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C 2674 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dispase II, powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D 2650 | Dimethyl sulfoxide |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Thermo Fisher Scientific | 00-4555-56 | Accutase |
| Fetal Bovine Serum, heat-inactivated | Thermo Fisher Scientific | 10438026 | |
| Hanks′ Balanced Salt solution | Thermo Fisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no phenol red |
| Leibovitz’s L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Normal Saline | Quality Biological | 114-055-101 | |
| Sucrose | Millipore Sigma | S 1888 | |
| Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter) | |||
| – 69.64 mL of Leibovitz's L-15 | |||
| – 17.66 mL of fetal bovine serum | |||
| – 3.42 g of sucrose | |||
| – 10.65 mL of DMSO | |||
| – 1 mL of antibiotic-antimycotic | |||
| Lab Plasticware and Supplies | |||
| 6-well Clear Flat Bottom Not Treated | Corning | 351146 | Falcon |
| Cell Strainer 100 µm | Fisher scientific | 352360 | Corning, Falcon |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 377267 | CryoTube 1.8 mL |
| Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm | Millipore Sigma | CLS430599 | 60EA |
| Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL | Fisher scientific | 352235 | Corning, Falcon |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm | Corning | 431154 | |
| Antibodies | |||
| ANPEP | BioLegend | 301703 | |
| CD34 | R&D Systems | FAB7227A | |
| CD45 | BioLegend | 304019 | |
| CD55 | BioLegend | 311306 | |
| CD 99 | BioLegend | 371308 | |
| PVRL | BioLegend | 340404 | |
| Surgical tools | |||
| long forceps (~150 mm length) | Fisherbrand | 12-000-128 | Fisher Scientific |
| medium forceps (~110 mm length) | Fisherbrand | 12-000-157 | Fisher Scientific |
| number 21 scalpel | Andwin Scientific | EF7281H | Fisher Scientific |
| number 11 scalpel | Andwin Scientific | FH/CX7281A | Fisher Scientific |
| sharp fine curved scissors | Roboz Surgical | RS-5881 | |
| Instruments | |||
| FACSJazz Flourescence activated cell sorter | BD | ||
| LSM 710 META Confocal microscope | Zeiss |
References
- Aghadavod, E., et al. Isolation of granulosa cells from follicular fluid; Applications in biomedical and molecular biology experiments. Advanced Biomedical Research. 4, 250 (2015).
- Man, L., et al. Comparison of human antral follicles of xenograft versus ovarian origin reveals disparate molecular signatures. Cell Reports. 32 (6), 108027 (2020).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Human Reproduction. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Human Reproduction. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Man, L., et al. Chronic superphysiologic AMH promotes premature luteinization of antral follicles in human ovarian xenografts. Science Advances. 8 (9), 7315 (2022).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocr Rev. 39 (1), 1-20 (2018).
- Asiabi, P., Dolmans, M. M., Ambroise, J., Camboni, A., Amorim, C. A. In vitro differentiation of theca cells from ovarian cells isolated from postmenopausal women. Human Reproduction. 35 (12), 2793-2807 (2020).
- Dalman, A., Totonchi, M., Valojerdi, M. R. Establishment and characterization of human theca stem cells and their differentiation into theca progenitor cells. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (12), 9853-9865 (2018).
