Her præsenterer vi en protokol til in vitro-udvælgelse af konstruerede transkriptionelle repressorer (ETR’er) med høj, langsigtet, stabil, on-target hæmningseffektivitet og lav genom-wide, off-target aktivitet. Denne arbejdsgang gør det muligt at reducere et indledende, komplekst repertoire af kandidat-ETR’er til en kort liste, der er egnet til yderligere evaluering i terapeutisk relevante indstillinger.
Geninaktivering er medvirkende til at studere genfunktion og repræsenterer en lovende strategi til behandling af en bred vifte af sygdomme. Blandt traditionelle teknologier lider RNA-interferens af delvis målophævelse og kravet om livslange behandlinger. I modsætning hertil kan kunstige nukleaser pålægge stabil geninaktivering gennem induktion af et DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB), men nylige undersøgelser stiller spørgsmålstegn ved sikkerheden ved denne tilgang. Målrettet epigenetisk redigering via konstruerede transkriptionelle repressorer (ETR’er) kan repræsentere en løsning, da en enkelt administration af specifikke ETR-kombinationer kan føre til holdbar hæmning uden at fremkalde DNA-brud.
ETR’er er proteiner, der indeholder et programmerbart DNA-bindende domæne (DBD) og effektorer fra naturligt forekommende transkriptionelle repressorer. Specifikt viste en kombination af tre ETR’er udstyret med KREB-domænet for human ZNF10, det katalytiske domæne for human DNMT3A og human DNMT3L, sig at inducere arvelige undertrykkende epigenetiske tilstande på ETR-målgenet. Denne platforms hit-and-run-karakter, den manglende indvirkning på målets DNA-sekvens og muligheden for at vende tilbage til den undertrykkende tilstand ved DNA-demethylering efter behov gør epigenetisk hæmning til et spilændrende værktøj. Et kritisk trin er identifikationen af de korrekte ETR’ers position på målgenet for at maksimere on-target og minimere off-target hæmning. Det kan være besværligt at udføre dette trin i den endelige prækliniske ex vivo- eller in vivo-indstilling .
Ved at tage CRISPR / katalytisk døde Cas9-system som en paradigmatisk DBD for ETR’er beskriver dette papir en protokol bestående af in vitro-skærmen af guide-RNA’er (gRNA’er) koblet til triple-ETR-kombinationen for effektiv hæmning på målet efterfulgt af evaluering af genom-wide specificitetsprofilen for tophits. Dette giver mulighed for at reducere det oprindelige repertoire af kandidat-gRNA’er til en kort liste over lovende, hvis kompleksitet er egnet til deres endelige evaluering i den terapeutisk relevante interesseindstilling.
Geninaktivering har traditionelt spillet en central rolle for at studere genfunktion i både cellulære og dyremodeller. Desuden er det i de sidste to årtier, med stigningen i genterapi, blevet foreslået som en potentielt spilændrende tilgang til behandling af sygdomme forårsaget af gain-of-function-mutationer1, infektionssygdomme2 eller patologier, hvor hæmning af et gen kan kompensere for en arvelig defekt i et andet3. Endelig er genetisk inaktivering af nøgleregulatorer af celleegnethed og funktionel kontrol blevet foreslået for at øge effektiviteten af celleprodukter til kræftimmunterapi4 og regenerativ medicin5.
Blandt de forskellige teknologier til at opnå geninaktivering er en af de mest lovende målrettet epigenetisk hæmning 6,7. Kernen i denne teknologi er de såkaldte konstruerede transkriptionelle repressorer (ETR’er), kimære proteiner bestående af et programmerbart DNA-bindende domæne (DBD) og et effektordomæne (ED) med epigenetisk repressiv funktion. Zinkfingerproteiner (ZFP’er)8, transkriptionsaktivatorlignende effektorer (TALEs)9 eller CRISPR/dCas910-baserede DBD’er kan designes til selektivt at binde ED til promotor/forstærkersekvensen af målgenet, der skal bringes til tavshed. Når den er der, udfører ED af ETR sin hæmningsaktivitet ved at pålægge heterochromatininducerende undertrykkende epigenetiske mærker såsom histonmodifikationer (H3K9 11,12 eller H3K27 13 methylering, H3 eller H4 deacetylation 14) og CpG DNA-methylering 15 i henhold til det anvendte undertrykkende domæne.
Især inspireret af de molekylære processer med permanent transkriptionel undertrykkelse af endogene retrovira, der forekommer i præimplantationsembryoet16, er der genereret en kombination af tre ETR’er for at udnytte følgende hormonforstyrrende stoffer: i) det Krüppel-associerede boksdomæne (KRAB) for human ZNF10; ii) det katalytiske domæne af humant de novo-DNA-methyltransferase 3A (DNMT3A) og iii) humant DNA-methyltransferase 3-lignende (DNMT3L) i fuld længde. KRAB er et konserveret undertrykkende domæne, der deles af flere ZEP’er hos højere hvirveldyr17,18, hvis hæmningsaktivitet hovedsageligt er baseret på dets evne til at rekruttere KAP1 19-et stilladsprotein, der derefter interagerer med flere andre heterochromatininduktorer20-omfattende nukleosomremodellerings- og deacetylationskomplekset (NuRD) 21, H3K9-histonmethyltransferase SETDB1 22 og H3K9-methyleringslæseren HP1 23, 24, blandt andre.
DNMT3A overfører aktivt methylgrupper på DNA’et ved CpG-sekvenser25. Den katalytiske aktivitet af DNMT3A forstærkes af dens fysiske tilknytning til DNMT3L, en embryo- og kimcellebegrænset paralog af DNMT3A, der mangler det katalytiske domæne, der er ansvarlig for methylgruppeoverførsel26,27. DNA-methylering i CpG-rige regioner – kaldet CpG-øer (CGI’er) – indlejret i promotor- / forstærkerelementerne i pattedyrgener er normalt forbundet med transkriptionshæmning28. Det er vigtigt, at når CpG-methylering er deponeret, kan den stabilt nedarves gennem mitose af et UHRF1-DNMT1-baseret molekylært kompleks29.
Stabil overekspression af ETR’erne i målcellen kan være problematisk, sandsynligvis på grund af den stigende risiko for aktivitet uden for målet og kvælning af endogene interaktorer fra deres fysiologiske målsteder over tid. Imidlertid kan forbigående ekspression af enkelt-ETR-dele ikke fremkalde langvarig hæmning med høj effektivitet30, hvilket hæmmer deres terapeutiske anvendelse. Derfor var et skelsættende gennembrud i feltet beviset for, at kombinationen af de tre KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-baserede ETR’er kan synergisere og, selv når de kun leveres forbigående, pålægge promotorsekvensen af målgenet H3K9 og CpG-methylering. Disse læses og formeres derefter af cellen gennem mitose, hvilket fører til arvelig hæmning i flere humane og murincellelinjer samt ex vivo-dyrkede primære celler30.
Det skal bemærkes, at den epigenetiske hæmning, der pålægges af ETR’erne, kan vendes tilbage efter behov ved målrettet (f.eks. rekruttering af den CRISPR/dCas9-baserede TET1-DNA-demethylase på det tavse locus) eller farmakologisk (administration af DNA-methyltransferasehæmmeren 5-Aza) DNA-demethylering30, en potentiel modgift i tilfælde af ETR-relaterede bivirkninger. Alt-i-en ETR’er, der bærer de tre KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-baserede ED’er, blev også beskrevet, hvilket viser signifikant hæmningseffektivitet i cellelinjer31,32 mod det store flertal af proteinkodende gener. Desuden rapporterede flere undersøgelser, der anvendte ETR’erne, en høj sikkerhedsprofil uden større aktivitet uden for målet med hensyn til de novo CpG-methylering eller ændring af kromatintilgængelighed30,31,32. Det anbefales dog at foretage en særlig analyse af specificitetsprofilen for ETR’er, der er udstyret med en nydesignet DBD, før kliniske anvendelser.
Fra et klinisk perspektiv kan målrettet epigenetisk hæmning give kritiske fordele for både RNA-interferens (RNAi)-baseret knockdown33 og kunstig nukleasebaseret genforstyrrelse8. I modsætning til RNAi kan målrettet epigenetisk hæmning inducere fuld ophævelse af dets mål pr. celle og kræver ikke periodisk behandling for at sikre langvarig hæmning; i modsætning til genforstyrrelse efterlader den DNA-sekvensen uændret og undgår generering af DNA-dobbeltstrengsbrud (DSB’er). DSB’er kan derefter inducere apoptose og cellecyklusstop, hvilket potentielt kan føre til en selektion mod celler med en funktionel p53-vej 34,35 og, især i multiplex-genredigeringsindstillinger, kromosomale omlejringer35. Ved at videreformidle det irreversible mosaikresultat af ikke-homologt end-joining-medieret DNA DSB-reparation36 kan genforstyrrelse desuden ikke undgå reparation af målet inden for rammen til funktionelle kodningssekvenser som et af de endelige resultater og kan i modsætning til epigenetisk hæmning ikke slettes efter behov.
Endelig har epigenetisk hæmning potentialet til at udvide rækken af målbare genetiske elementer til klasser, der er helt eller i det mindste delvist ildfaste over for RNAi og genforstyrrelser, såsom ikke-transskriberede regulatoriske elementer og ikke-kodende RNA’er30,32. Det første kritiske skridt for enhver målrettet epigenetisk hæmningsapplikation er at designe et panel af ETR’er, der dækker de forskellige regulatoriske sekvenser af målgenet og identificere de bedst ydende. Antallet af ETR’er, der skal testes, kan være afgørende i betragtning af den stigende andel af genomet, der kan målrettes af de programmerbare DNA-bindingsteknologier, der konstant er under udvikling37. Udførelse af skærmen af ETR’erne direkte på celletypen, hvor målgenet terapeutisk bringes til tavshed, ville være den mest relevante mulighed. Imidlertid kan skærme med høj kapacitet være teknisk besværlige i primære celler på grund af deres begrænsede overlevelse i kultur og deres ofte suboptimale tekniske kapacitet. Store skærme kan være endnu mere umulige in vivo.
Et mere praktisk alternativ består i først at udføre en indledende screening af et stort panel af ETR’er i let konstruerbare cellelinjer og derefter kun validere de mest lovende i den terapeutisk relevante celletype. Et parallelt spørgsmål er valget af en passende aflæsning til måling af dæmpningseffektiviteten af de europæiske fremskyndede køretøjer. Direkte vurdering af transkriptions- eller proteinniveauerne af målgenet ved RT-qPCR, western blot, eller ELISA kan være dyrt og tidskrævende og kan mangle tilstrækkelig følsomhed, hvilket begrænser deres anvendelse ved high-throughput skalaer. Genereringen af ad hoc-konstruerede reportercellelinjer, hvor en fluorofor placeres under transkriptionel kontrol af målgenets regulatoriske sekvenser, muliggør udnyttelse af den flowcytometribaserede tilgang til læsning af epigenetisk hæmning på enkeltcelleniveau og i højt gennemstrømningstempo.
Efter disse generelle overvejelser beskriver dette papir en protokol bestående af in vitro-arrayed screen af ETR’er for hæmningseffektivitet på målet efterfulgt af evaluering af den genom-dækkende off-target-aktivitet af de øverste hits. Denne arbejdsgang giver mulighed for at reducere det indledende repertoire af kandidat-ETR’er til en kort liste over lovende, hvis kompleksitet er egnet til deres endelige evaluering i den terapeutisk relevante celletype af interesse.
Blandt de forskellige programmerbare DBD’er, der kan udnyttes til at generere ETR’er, vil denne protokol fokusere på den CRISPR/dCas9-baserede teknologi på grund af den lette konstruktion af gRNA’er, der spænder over målgenpromotoren i en høj gennemstrømningsskala. Den samme konceptuelle arbejdsgang, der er beskrevet nedenfor, kan imidlertid anvendes til at evaluere effektiviteten og specificiteten af ETR’er udstyret med andre DBD’er.
Målrettet epigenetisk hæmning kan udgøre en lovende løsning til behandling af lidelser, der kan drage fordel af permanent geninaktivering, herunder sygdomme forårsaget af gain-of-function-mutationer1, infektionssygdomme2 og patologier, hvor hæmning af et gen enten kan kompensere for en arvelig defekt i et andet3 eller frigøre det fulde potentiale af adoptivcelleterapier4. 5. Ved at virke på kromatinniveau og blive autoformeret af cellen 7,30,32 kan epigenetisk hæmning undgå toksiske ændringer (f.eks. kromosomale omlejringer) af DNA-sekvensen af målgenet og delvis, forbigående hæmning af målet, som er begrænsninger for henholdsvis kunstig nukleasebaseret genforstyrrelse8,34,35 og RNAi-baseret knockdown 33.
Et af de vigtigste indledende trin i enhver epigenetisk hæmningsprotokol er at identificere den korrekte position på målgenet for at dirigere ETR’erne, der vil deponere de undertrykkende epigenetiske mærker, der er nødvendige for at slukke for målets transkriptionelle aktivitet. Forskellige transkriptionelle startsted-proksimale og -distale regulatoriske elementer kan være enige om at understøtte transkriptionel produktion af et givet humant gen54. Desuden kan der nu identificeres forskellige målsteder pr. specifikt reguleringselement takket være det stigende antal programmerbare DNA-bindingsteknologier6. Derfor kan protokoller, som den, der er beskrevet her i konstruerede cellelinjer, bruges til at nominere individuelle målsteder og / eller genomiske regioner, der er modtagelige for ETR-medieret epigenetisk hæmning, inden man går i gang med besværlig og tidskrævende evalueringsindsats af de bedste kandidater i den endelige terapeutiske indstilling. Nogle kritiske aspekter af protokollen beskrives yderligere nedenfor.
Konstruktion af en reportercellelinje, der forudsiger det endelige terapeutiske mål
På trods af den konstante optimering af celletekniske protokoller – der kræves her for at indsætte kassettekodningen for den fluorescerende reporter i målgenet og for at levere ETR’erne – kan det ikke tages for givet, at de måske allerede er tilgængelige for den cellelinje, der mest ligner det endelige terapeutiske mål mest. I dette tilfælde kan forskellige afbødningsstrategier anvendes: a) drage fordel af optimeringssæt leveret af leverandører til internt at optimere transfektionsprotokollen for målcellelinjen; b) skift til andre cellelinjer, der stadig udtrykker dette målgen, men tilhører andre væv end det endelige terapeutiske mål, for hvilke der er udviklet omfattende tekniske protokoller. Hvis disse muligheder ikke er tilgængelige, kan man overveje at skifte til primære celletyper eller organoider, der repræsenterer det endelige mål. Som en generel overvejelse for både prækliniske undersøgelser og terapeutiske anvendelser af ETR-baseret epigenetisk hæmning bør scenarier, hvor målgenet er afgørende for målcelletypen, kasseres. Den fuldstændige, langsigtede hæmning af et essentielt gen, der pålægges af ETR’erne, vil føre til modudvælgelse af målcellerne over tid (og potentielt toksicitet af behandlingen). Alternative teknologier, der giver delvis målabrogation, såsom RNAi33, foretrækkes i disse tilfælde.
Evaluering af ETR’ernes dæmpningsaktivitet på målet
ETR’er baseret på kombinationen af KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-effektordomæner har vist sig at være effektive mod det store flertal af proteinkodende gener med et bredt omkring 1 kilobase lang-tilladende målretningsvindue centreret på transkriptionsstartstedet32. For at få en fornemmelse af, hvordan et veludført epigenetisk hæmningseksperiment ser ud, gives de tekniske detaljer og resultater af hæmning af B2M-genet i K-562-celler her. Dette kan betragtes som en vigtig positiv kontrol, der ikke kun skal inkluderes af forskere, der arbejder med K-562-celler, men også af dem, der nærmer sig den ETR-baserede teknologi for første gang. Som anført i protokollen anbefales kunstig nuklease (f.eks. CRISPR/Cas9)-baseret genforstyrrelse som en yderligere kontrol af både effektiviteten af genlevering i den pågældende celletype og fænotypen af celler, der er berøvet målgenet. Efter den indledende screening af gRNA’er, der skal kobles med de CRISPR/dCas9-baserede ETR’er, hvis ingen af de testede gRNA’er er i stand til permanent at tavse målgenet, bør man overveje i følgende rækkefølge: 1) at øge mængden af leverede gRNA’er og ETR’er; 2) test af puljer af de bedste gRNA’er på udkig efter synergistiske effekter mellem dem. Hvis langsigtet hæmning stadig ikke opnås, bør man overveje: 3) at teste yderligere gRNA’er, som kan målrette mod steder, der er mere relevante for at instruere epigenetisk hæmning; 4) skift til ZFP8– eller TALE9-baserede DBD-platforme, som kan have en forbedret bindingskapacitet til målkromatinet; 5) skift fra forbigående til stabil – for eksempel integrering af viral vektorbaseret ekspression af ETR’erne (enten gRNA- eller dCas9-fusionskonstruktionerne eller begge dele, når CRISPR / dCas9-teknologien vedtages). Da vores gruppe udviklede og har solid erfaring med fælles levering af de tre separate ETR’er30, er protokollen og resultaterne vist her baseret på denne tilgang. Imidlertid kan en lignende konceptuel arbejdsgang sandsynligvis anvendes til et alt-i-et CRISPR-baseret system32.
Evaluering af ETR’ernes ikke-målrelaterede aktivitet
Flere undersøgelser har vist foreløbige in vitro-indikationer af specificiteten af ETR’er baseret på kombinationen af KRAB-, DNMT3A- og DNMT3L-effektordomæner30,31,32. Men hvis ingen af de testede gRNA’er viser en tilfredsstillende specificitetsprofil med hensyn til transkriptionsregulering og/eller de novo DNA-methylering, kan man forfølge to strategier, der ikke udelukker hinanden: a) at reducere opholdstiden for ETR’erne inde i cellen (og dermed deres potentielle off-target-aktivitet) ved enten at reducere doserne af ETR’er eller teste alternative leveringssystemer. For eksempel forventes både mRNA og proteinlevering sammenlignet med plasmider at reducere celleeksponeringstiden for ETR’erne og følgelig sandsynligheden for aktivitet uden for målet55; b) skifte til nyere Cas9-varianter, optimeret til at reducere off-target-bindingen af platform56 eller til alternative ZFP8– eller TALE9-baserede DNA-bindingsteknologier. Det er vigtigt at tage i betragtning, at sammenlignet med mock-behandlede prøver påvirkes genhæmningens on-target og off-target aktivitet ikke kun af DBD’s binding til deres målsekvens, men også af den potentielle kapacitet af de epigenetiske effektordomæner, der kan rekrutteres til andre loci ved deres naturlige, endogene cofaktorer. En reduktion af opholdstiden for ETR’erne i målcellen kan derfor mindske ikke blot sandsynligheden for binding af DBD til steder uden for målområdet, men også sandsynligheden for, at ETR’erne interagerer med endogene cofaktorer med potentielle fordele i form af specificitet og ulemper med hensyn til aktivitet på målet. Endelig, sammenlignet med mock-behandlede prøver, kan nogle af de transkriptionelle og mindre sandsynlige CpG-methyleringsændringer målt i tavse celler simpelthen udledes ved berøvelse af målgenet. Disse betragtes ikke som ikke-mål for lyddæmpningsteknologien. For at identificere dem bør man også inkludere genforstyrrelse ved kunstig nuklease i forsøgspanelet 8,9,10. Biologiske ændringer som følge af det funktionelle tab af målgenet vil blive delt mellem epigenetisk hæmning og denne alternative teknologi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica og Deborah Cipria for den fælles indsats for at udvikle den epigenetiske hæmningsteknologi gennem årene; Dejan Lazarevic og Francesca Giannese for kritisk gennemgang af RNA-seq og MeDIP-seq analyserne beskrevet i protokollen. Dette arbejde blev støttet af tilskud til A.L. fra Telethon Foundation (TIGET-bevilling nr. F1) og EU’s Horizon 2020-program (UPGRADE). Der er skabt illustrationer med BioRender.com.
FORFATTERNES BIDRAG
A.M., M.A.C., F.G. og A.C. bidrog til udformningen af protokollen og til at skrive manuskriptet; S.V., I.M. og D.C. designede protokollens bioinformatikafsnit og reviderede manuskriptet; A.M. og A.L. designede protokollen, udtænkte og skrev manuskriptet med input fra alle forfatterne.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |