Här presenterar vi ett protokoll för in vitro-selektion av konstruerade transkriptionsrepressorer (ETR) med hög, långsiktig, stabil, on-target avstängningseffektivitet och låg genom-wide, off-target aktivitet. Detta arbetsflöde gör det möjligt att reducera en inledande, komplex repertoar av ETR-kandidater till en kort lista, lämplig för vidare utvärdering i terapeutiskt relevanta miljöer.
Geninaktivering är avgörande för att studera genfunktion och representerar en lovande strategi för behandling av ett brett spektrum av sjukdomar. Bland traditionella tekniker lider RNA-interferens av partiell målabrogation och kravet på livslånga behandlingar. Däremot kan artificiella nukleaser införa stabil geninaktivering genom induktion av ett DNA-dubbelsträngsbrott (DSB), men nya studier ifrågasätter säkerheten för detta tillvägagångssätt. Riktad epigenetisk redigering via konstruerade transkriptionsrepressorer (ETR) kan vara en lösning, eftersom en enda administrering av specifika ETR-kombinationer kan leda till varaktig nedtystning utan att inducera DNA-brott.
ETR är proteiner som innehåller en programmerbar DNA-bindande domän (DBD) och effektorer från naturligt förekommande transkriptionsrepressorer. Specifikt visade sig en kombination av tre ETR:er utrustade med KRAB-domänen av humant ZNF10, den katalytiska domänen av humant DNMT3A och humant DNMT3L, inducera ärftliga repressiva epigenetiska tillstånd på ETR-målgenen. Plattformens hit-and-run-karaktär, avsaknaden av påverkan på målets DNA-sekvens och möjligheten att återgå till det repressiva tillståndet genom DNA-demetylering på begäran, gör epigenetisk nedtystning till ett spelförändrande verktyg. Ett kritiskt steg är att identifiera rätt ETR:s position på målgenen för att maximera on-target och minimera off-target tystnad. Att utföra detta steg i den slutliga ex vivo- eller in vivo-prekliniska miljön kan vara besvärligt.
Med CRISPR/katalytiskt dött Cas9-system som en paradigmatisk DBD för ETR, beskriver denna artikel ett protokoll som består av in vitro-screening av guide-RNA (gRNA) kopplade till trippel-ETR-kombinationen för effektiv nedtystning på målet, följt av utvärdering av den genomomfattande specificitetsprofilen för toppträffar. Detta gör det möjligt att reducera den initiala repertoaren av kandidat-gRNA till en kort lista över lovande sådana, vars komplexitet är lämplig för deras slutliga utvärdering i den terapeutiskt relevanta miljön av intresse.
Geninaktivering har traditionellt spelat en nyckelroll för att studera genernas funktion i både cell- och djurmodeller. Dessutom, under de senaste två decennierna, med framväxten av genterapi, har det föreslagits som ett potentiellt omvälvande tillvägagångssätt för att behandla sjukdomar orsakade av gain-of-function-mutationer1, infektionssjukdomar2 eller patologier där avstängning av en gen kan kompensera för en ärftlig defekt i en annan3. Slutligen har genetisk inaktivering av nyckelregulatorer för cellkondition och funktionell kontroll föreslagits för att förbättra effektiviteten hos cellprodukter för cancerimmunterapi4 och regenerativ medicin5.
Bland de olika teknikerna för att åstadkomma geninaktivering är en av de mest lovande riktad epigenetisk avstängning 6,7. Kärnan i denna teknik är så kallade Engineered Transcriptional Repressorer (ETR), chimära proteiner som består av en programmerbar DNA-bindande domän (DBD) och en effektordomän (ED) med epigenetisk repressiv funktion. Zinkfingerproteiner (ZFPs)8, transkriptionsaktivatorliknande effektorer (TALEs)9 eller CRISPR/dCas910-baserade DBD:er kan utformas för att selektivt binda ED till promotor-/förstärkarsekvensen för målgenen som ska tystas. Väl där utför ETR:s ED sin tystande aktivitet genom att införa heterokromatininducerande repressiva epigenetiska markörer såsom histonmodifieringar (H3K9 11,12 eller H3K27 13 metylering, H3 eller H4 deacetylering 14) och CpG DNA-metylering 15, beroende på den repressiva domän som används.
I synnerhet, inspirerad av de molekylära processerna för permanent transkriptionell repression av endogena retrovirus som förekommer i det preimplantationella embryot16, har en kombination av tre ETR genererats för att utnyttja följande ED: i) Krüppel-associated box (KRAB) domänen av humant ZNF10; ii) den katalytiska domänen av humant de novo-DNA-metyltransferas 3A (DNMT3A), och iii) det humana DNA-metyltransferas 3-liknande (DNMT3L) i full längd. KRAB är en konserverad repressiv domän som delas av flera ZFP hos högre ryggradsdjur17,18, vars avstängningsaktivitet huvudsakligen baseras på dess förmåga att rekrytera KAP1 19-a scaffold-protein som sedan interagerar med flera andra heterokromatininducerare20-bestående av nukleosomremodellerings- och deacetyleringskomplexet (NuRD) 21, H3K9-histonmetyltransferas SETDB1 22 och H3K9-metyleringsläsaren HP1 23, 24, bland andra.
DNMT3A överför aktivt metylgrupper på DNA vid CpG-sekvenser25. Den katalytiska aktiviteten hos DNMT3A förstärks av dess fysiska association med DNMT3L, en embryo- och könscellsbegränsad paralog av DNMT3A som saknar den katalytiska domänen som är ansvarig för metylgruppöverföring26,27. DNA-metylering i CpG-rika regioner – så kallade CpG-öar (CGI) – inbäddad i promotor-/förstärkarelementen i däggdjursgener är vanligtvis förknippad med nedtystning av transkription28. Det är viktigt att CpG-metylering, när den väl har deponerats, kan ärvas stabilt under hela mitosen av ett UHRF1-DNMT1-baserat molekylkomplex29.
Stabilt överuttryck av ETR i målcellen kan vara problematiskt, sannolikt på grund av de ökande riskerna för aktivitet utanför målet och kvävning av endogena interaktorer från deras fysiologiska målplatser över tid. Övergående uttryck av enstaka ETR-delar kan dock misslyckas med att inducera långvarig avstängning med hög effektivitet30, vilket hämmar deras terapeutiska tillämpning. Ett banbrytande genombrott inom området var därför bevisen för att kombinationen av de tre KRAB-, DNMT3A- och DNMT3L-baserade ETR:erna kan synergisera och, även när de endast levereras tillfälligt, påtvinga promotorsekvensen för målgenen H3K9 och CpG-metylering. Dessa läses sedan av och förökas av cellen genom hela mitosen, vilket leder till ärftlig nedtystning i flera humana och murina cellinjer, såväl som ex vivo-odlade primära celler30.
Det bör noteras att den epigenetiska avstängning som ETR medför kan återställas på begäran genom riktad (t.ex. rekrytering av det CRISPR/dCas9-baserade TET1-DNA-demetylaset på det tystade lokuset) eller farmakologiska (administrering av DNA-metyltransferashämmaren 5-Aza) DNA-demetylering30, en potentiell antidot vid ETR-relaterade biverkningar. Allt-i-ett-ETR:er med de tre KRAB-, DNMT3A- och DNMT3L-baserade ED:erna beskrevs också, vilket visade signifikanta avstängningseffektivitet i cellinjer31,32 mot den stora majoriteten av proteinkodande gener. Dessutom rapporterade flera studier där ETR användes en hög säkerhetsprofil, utan någon större aktivitet utanför målet när det gäller de novo CpG-metylering eller förändring av kromatintillgängligheten30,31,32. En särskild analys av specificitetsprofilen för ETR utrustade med en nydesignad DBD rekommenderas dock före kliniska tillämpningar.
Ur ett kliniskt perspektiv kan riktad epigenetisk avstängning ge kritiska fördelar för både RNA-interferens (RNAi)-baserad knockdown33 och artificiell nukleasbaserad genstörning8. Till skillnad från RNAi kan riktad epigenetisk avstängning inducera fullständig upphävning av dess mål per cell och kräver inte periodisk behandling för att säkerställa långvarig avstängning; i motsats till genstörningar lämnar den DNA-sekvensen oförändrad, vilket undviker generering av DNA-dubbelsträngsbrott (DSB). DSB kan sedan inducera apoptos och cellcykelstopp, vilket potentiellt kan leda till en selektion mot celler med en funktionell p53-väg 34,35 och, särskilt i multiplexa genredigeringsinställningar, kromosomala omarrangemang35. Dessutom, genom att vidarebefordra det irreversibla mosaikresultatet av icke-homologt-end-joining-medierad DNA-DSB-reparation36, kan genstörning inte undvika reparation av målet i bildrutan till funktionella kodande sekvenser som ett av de slutliga resultaten och, till skillnad från epigenetisk avstängning, kan den inte raderas på begäran.
Slutligen har epigenetisk avstängning potential att bredda utbudet av målinriktade genetiska element till klasser som är helt eller åtminstone delvis resistenta mot RNAi och genstörningar, såsom icke-transkriberade regulatoriska element och icke-kodande RNA30,32. Det första kritiska steget för en riktad epigenetisk avstängningsapplikation är att utforma en panel av ETR:er som täcker de olika regulatoriska sekvenserna av målgenen och identifiera de bäst presterande. Antalet ETR:er som ska testas kan vara avgörande, med tanke på den ökande andel av genomet som kan angripas av de programmerbara DNA-bindningstekniker som ständigt är under utveckling37. Det mest relevanta alternativet skulle vara att screena ETR direkt på den celltyp där målgenen kan tystas terapeutiskt. Skärmar med hög genomströmning kan dock vara tekniskt besvärliga i primära celler på grund av deras begränsade överlevnad i odling och deras ofta suboptimala tekniska kapacitet. Storskaliga skärmar kan vara ännu mer ogenomförbara in vivo.
Ett mer praktiskt alternativ består av att först utföra en första screening av en stor panel av ETR:er i lätt konstruerade cellinjer, och sedan bara validera de mest lovande i den terapeutiskt relevanta celltypen. En parallell fråga är valet av en lämplig avläsning för att mäta ETR:s ljuddämpningseffektivitet. Att direkt bedöma transkript- eller proteinnivåerna i målgenen med RT-qPCR, western blot eller ELISA kan vara kostsamt och tidskrävande och kan sakna tillräcklig sensibilitet, vilket begränsar deras tillämpning vid storskaliga skalor. Genereringen av ad hoc-konstruerade reportercellinjer där en fluorofor placeras under transkriptionell kontroll av målgenens regulatoriska sekvenser möjliggör utnyttjande av den flödescytometribaserade metoden för att läsa epigenetisk avstängning på encellsnivå och med hög genomströmningstakt.
Efter dessa allmänna överväganden beskriver denna artikel ett protokoll som består av in vitro-arrayad screening av ETR:er för effektivitet av nedtystning på målet, följt av utvärdering av den genomomfattande off-target-aktiviteten hos de bästa träffarna. Detta arbetsflöde gör det möjligt att reducera den initiala repertoaren av ETR-kandidater till en kort lista över lovande sådana, vars komplexitet är lämplig för deras slutliga utvärdering i den terapeutiskt relevanta celltypen av intresse.
Bland de olika programmerbara DBD:er som kan utnyttjas för att generera ETR:er kommer detta protokoll att fokusera på den CRISPR/dCas9-baserade tekniken, på grund av att det är lätt att designa gRNA som spänner över målgenpromotorn i en skala med hög genomströmning. Samma konceptuella arbetsflöde som beskrivs nedan kan dock användas för att utvärdera effektiviteten och specificiteten hos ETR som är utrustade med andra DBD:er.
Riktad epigenetisk avstängning kan utgöra en lovande lösning för att behandla sjukdomar som kan dra nytta av permanent geninaktivering, inklusive sjukdomar orsakade av gain-of-function-mutationer1, infektionssjukdomar2 och patologier där avstängning av en gen antingen kan kompensera för en ärftlig defekt i en annan3 eller frigöra den fulla potentialen hos adoptiva cellterapier4, 5. veckor Genom att verka på kromatinnivå och förökas automatiskt av cellen 7,30,32 kan epigenetisk avstängning undvika toxiska förändringar (t.ex. kromosomala omlagringar) av målgenens DNA-sekvens och partiell, övergående avstängning av målet, vilket är begränsningar för artificiell nukleasbaserad genstörning 8,34,35 respektive RNAi-baserad knockdown 33.
Ett av de viktigaste preliminära stegen i alla epigenetiska avstängningsprotokoll är att identifiera den rätta positionen på målgenen för att styra de ETR:er som kommer att deponera de repressiva epigenetiska markörer som är nödvändiga för att stänga av målets transkriptionsaktivitet. Olika transkriptionella startplats-proximala och -distala regulatoriska element kan samverka för att stödja transkriptionsproduktionen av en given human gen54. Dessutom kan olika målplatser per specifikt regulatoriskt element nu identifieras tack vare det växande antalet programmerbara DNA-bindningstekniker6. Därför kan protokoll, som det som beskrivs här i Engineered Cellines, användas för att nominera enskilda målplatser och/eller genomiska regioner som är mottagliga för ETR-medierad epigenetisk avstängning, innan man påbörjar besvärliga och tidskrävande utvärderingsinsatser av de bästa kandidaterna i den slutliga terapeutiska miljön. Några kritiska aspekter av protokollet beskrivs närmare nedan.
Konstruktion av en reportercellinje som förutsäger det slutliga terapeutiska målet
Trots den ständiga optimeringen av celltekniska protokoll – som krävs här för att sätta in kassetten som kodar för den fluorescerande reportern i målgenen och för att leverera ETR:erna – kan det inte tas för givet att de kanske redan är tillgängliga för den cellinje som mest liknar det slutliga terapeutiska målet mest. I det här fallet kan olika begränsningsstrategier tillämpas: a) dra nytta av optimeringssatser som tillhandahålls av leverantörer för att internt optimera transfektionsprotokollet för målcellinjen; b) byte till andra cellinjer som fortfarande uttrycker målgenen men som tillhör andra vävnader än det slutliga terapeutiska målet – för vilka tekniska protokoll har optimerats i stor utsträckning. Om dessa alternativ inte är tillgängliga kan man överväga att byta till primära celltyper eller organoider som representerar det slutliga målet. Som ett allmänt övervägande för både prekliniska studier och terapeutiska tillämpningar av ETR-baserad epigenetisk avstängning bör scenarier där målgenen är avgörande för målcelltypen förkastas. En fullständig, långsiktig nedtystning av en essentiell gen som påtvingas av ETR kommer att leda till motselektion av målcellerna över tid (och, potentiellt, toxicitet av behandlingen). Alternativa tekniker som ger partiell målabrogation, såsom RNAi33, är att föredra i dessa fall.
Utvärdering av den målinriktade nedtystningsaktiviteten hos de effektiva återkommande aktörerna
ETR:er baserade på kombinationen av KRAB-, DNMT3A- och DNMT3L-effektordomäner har visat sig vara effektiva mot den stora majoriteten av proteinkodande gener, med ett brett 1 kilobas långt tillåtande målfönster centrerat på transkriptionsstartstället32. För att få en känsla av hur ett väl utfört epigenetiskt avstängningsexperiment ser ut, finns de tekniska detaljerna och resultaten av att tysta B2M-genen i K-562-celler här. Detta kan betraktas som en viktig positiv kontroll som ska inkluderas inte bara av forskare som arbetar med K-562-celler utan också av dem som närmar sig den ETR-baserade tekniken för första gången. Som anges i protokollet rekommenderas artificiell nukleas (t.ex. CRISPR/Cas9)-baserad genstörning som en ytterligare kontroll av både effektiviteten av genleverans i den aktuella celltypen och av fenotypen hos celler som berövats målgenen. Efter den första screeningen av gRNA som ska kopplas till CRISPR/dCas9-baserade ETR, om ingen av de testade gRNA:erna permanent kan tysta målgenen, bör man överväga, i följande ordning: 1) öka mängden gRNA och ETR som levereras; 2) testa pooler av de bästa gRNA:erna och leta efter synergistiska effekter mellan dem. Om långvarig avstängning fortfarande inte uppnås bör man överväga: 3) testa ytterligare gRNA, som kan rikta in sig på platser som är mer relevanta för att instruera epigenetisk avstängning; 4) byte till ZFP8– eller TALE9-baserade DBD-plattformar, som kan ha en förbättrad bindningsförmåga till målkromatinet; 5) byta från transient till stabil – till exempel integrera viralt vektorbaserat uttryck av ETR:erna (antingen gRNA- eller dCas9-fusionskonstruktionerna eller båda när man använder CRISPR/dCas9-tekniken). Eftersom vår grupp utvecklade, och har gedigen erfarenhet av, samleverans av de tre separata ETR:erna30, är protokollet och resultaten som visas här baserade på detta tillvägagångssätt. Ett liknande konceptuellt arbetsflöde kan dock sannolikt tillämpas för ett allt-i-ett CRISPR-baserat system32.
Utvärdering av de effektiva skattesatsernas verksamhet utanför målet
Flera studier har visat preliminära in vitro-indikationer på specificiteten hos ETR baserat på kombinationen av KRAB-, DNMT3A- och DNMT3L-effektordomänerna30,31,32. Om dock ingen av de testade gRNA:erna uppvisar en tillfredsställande specificitetsprofil när det gäller transkriptionsreglering och/eller de novo-DNA-metylering, kan man använda sig av två icke-ömsesidigt uteslutande strategier: a) att minska ETR:ernas uppehållstid inuti cellen (och följaktligen deras potentiella aktivitet utanför målet) genom att antingen minska doserna av ETR eller testa alternativa leveranssystem. Jämfört med plasmider förväntas till exempel både mRNA- och proteinleverans minska cellens exponeringstid för ETR och därmed sannolikheten för aktivitet utanför målet55. b) byta till nyare Cas9-varianter, optimerade för att minska off-target-bindningen av plattformen56, eller till alternativa ZFP8– eller TALE9-baserade DNA-bindningstekniker. Det är viktigt att ta hänsyn till att, jämfört med prover, påverkas aktiviteten vid nedtystning av gener inte bara av DBD:ns bindning till målsekvensen utan också av den potentiella kapaciteten hos de epigenetiska effektordomänerna att rekryteras till andra loci av deras naturliga, endogena kofaktorer. En minskning av uppehållstiden för ETR i målcellen kan därför minska inte bara sannolikheten för DBD-bindning till platser utanför målområdet, utan även sannolikheten för att ETR interagerar med endogena kofaktorer, med potentiella fördelar i form av specificitet och nackdelar i form av aktivitet på målet. Slutligen, jämfört med skenbehandlade prover, kan några av de transkriptionella och mindre sannolika CpG-metyleringsförändringarna som uppmätts i tystade celler helt enkelt härledas genom berövande av målgenen. Dessa anses inte vara off-targets för ljuddämpningstekniken. För att identifiera dem bör man också inkludera genstörning av artificiellt nukleas i experimentpanelen 8,9,10. Biologiska förändringar på grund av funktionsförlusten av målgenen kommer att delas mellan epigenetisk avstängning och denna alternativa teknik.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica och Deborah Cipria för samarbetet för att utveckla den epigenetiska avstängningstekniken genom åren; Dejan Lazarevic och Francesca Giannese för kritisk granskning av RNA-seq- och MeDIP-seq-analyserna som beskrivs i protokollet. Detta arbete stöddes av bidrag till A.L. från Telethon Foundation (TIGET-anslag nr F1) och EU:s Horizon 2020-program (UPGRADE). Illustrationer har skapats med BioRender.com.
FÖRFATTARENS BIDRAG
A.M., M.A.C., F.G. och A.C. bidrog till utformningen av protokollet och till att skriva manuskriptet; S.V., I.M. och D.C. utformade de bioinformatiska avsnitten i protokollet och reviderade manuskriptet; A.M. och A.L. utformade protokollet, utarbetade och skrev manuskriptet med input från alla författare.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |