En platform med høj kapacitet til kultur og 3D-billeddannelse af organoider
Summary
Dette papir præsenterer en fabrikationsprotokol for en ny type kultursubstrat med hundredvis af mikrobeholdere pr. mm2, hvor organoider kan dyrkes og observeres ved hjælp af mikroskopi med høj opløsning. Protokollerne for cellesåning og immunfarvning er også detaljerede.
Abstract
Karakteriseringen af et stort antal tredimensionelle (3D) organotypiske kulturer (organoider) ved forskellige opløsningsskalaer er i øjeblikket begrænset af standard billeddannelsesmetoder. Denne protokol beskriver en måde at forberede mikrofabrikerede organoidkulturchips på, som muliggør multiskala, 3D live imaging på et brugervenligt instrument, der kræver minimal manipulation og er i stand til op til 300 organoider / h billeddannelsesgennemstrømning. Disse kulturchips er kompatible med både luft- og nedsænkningsmål (luft, vand, olie og silikone) og en lang række almindelige mikroskoper (f.eks. Roterende disk, punktscanner konfokal, bredt felt og brightfield). Desuden kan de bruges med lysarkmodaliteter såsom enkeltobjektiv, enkeltplan belysningsmikroskopi (SPIM) teknologi (soSPIM).
Protokollen beskrevet her giver detaljerede trin til fremstilling af de mikrofabrikerede kulturchips og kultur og farvning af organoider. Der kræves kun kort tid for at blive fortrolig med, og forbrugsstoffer og udstyr kan let findes i normale biolabs. Her vil 3D-billeddannelsesfunktionerne kun blive demonstreret med kommercielle standardmikroskoper (f.eks. Roterende disk til 3D-rekonstruktion og bredfeltmikroskopi til rutinemæssig overvågning).
Introduction
I organotypiske 3D-cellekulturer, i det følgende benævnt organoider, differentierer stamceller og selvorganiserer sig i rumlige strukturer, der deler stærke morfologiske og funktionelle ligheder med virkelige organer. Organoider tilbyder værdifulde modeller til at studere menneskelig biologi og udvikling uden for kroppen 1,2,3. Et stigende antal modeller udvikles, der efterligner leveren, hjernen, nyrerne, lungerne og mange andre organer 2,4,5. Differentiering i organoider styres ved tilsætning af opløselige vækstfaktorer og en ekstracellulær matrix i en præcis tidssekvens. I markant modsætning til organer er udviklingen af organoider imidlertid ret heterogen.
Ud over adskillige biologiske udfordringer6,7 udgør organoidkulturer også teknologiske udfordringer med hensyn til cellekulturmetoder, karakterisering af transkriptomik og billeddannelse. In vivo organudvikling sker i et biologisk miljø, der resulterer i en meget stereotyp selvorganisering af cellearrangementer. Enhver fænotypisk ændring kan bruges som en proxy til at diagnosticere en syg tilstand. I modsætning hertil udvikler organoider in vitro i minimalt kontrollerede mikromiljøer, der er kompatible med cellekulturbetingelser, hvilket resulterer i stor variation i udviklingsvejen og formdannelsen for hver enkelt organoid.
En nylig undersøgelse8 viste, at kvantitativ billeddannelse af organoid form (fænotypedeskriptorer) kombineret med vurderingen af nogle få genetiske markører gør det muligt at definere fænotypiske udviklingslandskaber. Evnen til at relatere mangfoldigheden af genomisk ekspression i organoider med deres fænotypiske adfærd er uden tvivl et stort skridt i retning af at frigøre det fulde potentiale i organotypiske kulturer. Således beder det om udvikling af dedikerede, billeddannelsesmetoder med højt indhold, der muliggør karakterisering af organoidfunktioner på subcellulære, multicellulære og helorganoide skalaer i 3D 9,10.
Vi udviklede en alsidig HCS-platform (high-content screening), der muliggør strømlinet organoidkultur (fra isolerede humane embryonale stamceller [hESC’er], humant inducerede pluripotente stamceller [hIPSC’er] eller primære celler til 3D, multicellulære, differentierede organoider) og hurtig, ikke-invasiv 3D-billeddannelse. Det integrerer en næste generations miniaturiseret 3D-cellekulturenhed, kaldet JeWells-chippen ( chippen herefter), der indeholder tusindvis af velarrayed mikrobrønde flankeret med 45 ° spejle, der muliggør hurtig 3D, høj opløsning billeddannelse ved enkeltobjektiv lysarkmikroskopi11. Kompatibel med ethvert standard, kommercielt, omvendt mikroskop, muliggør dette system billeddannelse af 300 organoider i 3D med subcellulær opløsning på <1 time.
Mikrofabrikationen af cellekulturindretningen starter fra en eksisterende mikrostruktureret form, der indeholder hundredvis af mikropyramider (figur 1A) med en firkantet base og sidevægge ved 45 ° i forhold til basen. Figur 1C viser elektronmikroskopbilleder (EM) af sådanne strukturer. Selve formen er lavet af poly (dimethylsiloxan) (PDMS) og kan fremstilles som en replika støbning af en primær form (ikke vist her) med tilsvarende funktioner (som hulrum) ved hjælp af standard blød-litografiske procedurer. Den primære form kan fremstilles ved forskellige procedurer. Den, der blev brugt til denne protokol, blev fremstillet ved hjælp af siliciumvådætsning som rapporteret i Galland et al. 11; Proceduren til fremstilling af den primære form er ikke kritisk for denne protokol. Pyramiderne er arrangeret i et kvadreret array med samme tonehøjde for X- og Y-retningerne (i dette tilfælde er tonehøjden 350 μm).
Som en illustration blev proof-of-concept-eksperimenter12 offentliggjort for at demonstrere, at chippen tillader langsigtet kultur (måneder) og differentieringsprotokoller, samtidig med at antallet af indledende celler i brøndene præcist defineres. Individuel udvikling af et stort antal organoider kan automatisk overvåges live ved hjælp af standard brightfield og 3D lysark fluorescens mikroskoper. Desuden kan organoider hentes for at udføre yderligere biologiske undersøgelser (fx transkriptomisk analyse). Dette papir skitserer detaljerede protokoller til fremstilling af cellekulturdæksedler, sånings- og farvningsproceduren for fluorescensmikroskopi samt hentning af organoiderne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåden til fremstilling af mikrobrøndkulturskålen, som tillader organoidkultur og differentiering med høj densitet, er beskrevet i dette papir. På grund af geometrien og arrangementet af mikrohulrummene kan tusindvis af sfæroider dyrkes og farves i en enkelt plade i lange perioder (flere uger eller mere) næsten uden tab af materiale. Til sammenligning kan et område på 4 mm x 2 mm på cellekulturpladen indeholde så mange sfæroider som en enkelt 384-brøndplade med et areal på 12 cm x 8 cm.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen er støttet af CALIPSO-projektet støttet af National Research Foundation, premierministerens kontor, Singapore, under dets Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE) program. V.V. anerkender støtten fra NRF-efterforsker NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI-frøfinansiering og ANR ADGastrulo. A.B. og G.G. anerkender støtten fra MBI’s kernefinansiering. A.B. anerkender Andor Technologies for lånet af BC43-mikroskopet.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M. Organoids by design. Science. 364 (6444), 956-959 (2019).
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O’Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
