Una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3D di organoidi
Summary
Questo documento presenta un protocollo di fabbricazione per un nuovo tipo di substrato di coltura con centinaia di microcontenitori per mm2, in cui gli organoidi possono essere coltivati e osservati utilizzando la microscopia ad alta risoluzione. Anche i protocolli di semina cellulare e immunocolorazione sono dettagliati.
Abstract
La caratterizzazione di un gran numero di colture organotipiche tridimensionali (3D) (organoidi) a diverse scale di risoluzione è attualmente limitata da approcci di imaging standard. Questo protocollo descrive un modo per preparare chip di coltura organoidi microfabbricati, che consentono l’imaging live 3D multiscala su uno strumento intuitivo che richiede manipolazioni minime e in grado di produrre fino a 300 organoidi / h. Questi chip di coltura sono compatibili con obiettivi sia ad aria che ad immersione (aria, acqua, olio e silicone) e con una vasta gamma di microscopi comuni (ad esempio, disco rotante, scanner puntiforme confocale, campo largo e campo chiaro). Inoltre, possono essere utilizzati con modalità light-sheet come la tecnologia di microscopia a luce singola (SPIM) a obiettivo singolo (soSPIM).
Il protocollo qui descritto fornisce passaggi dettagliati per la preparazione dei trucioli di coltura microfabbricati e la coltura e la colorazione degli organoidi. È necessario solo un breve periodo di tempo per familiarizzare e materiali di consumo e attrezzature possono essere facilmente trovati nei normali laboratori biologici. Qui, le capacità di imaging 3D saranno dimostrate solo con microscopi standard commerciali (ad esempio, disco rotante per la ricostruzione 3D e microscopia a campo largo per il monitoraggio di routine).
Introduction
Nelle colture cellulari 3D organotipiche, di seguito denominate organoidi, le cellule staminali si differenziano e si auto-organizzano in strutture spaziali che condividono forti somiglianze morfologiche e funzionali con organi reali. Gli organoidi offrono modelli preziosi per studiare la biologia umana e lo sviluppo al di fuori del corpo 1,2,3. Un numero crescente di modelli sono in fase di sviluppo che imitano il fegato, il cervello, i reni, i polmoni e molti altri organi 2,4,5. La differenziazione negli organoidi è diretta dall’aggiunta di fattori di crescita solubili e di una matrice extracellulare in una precisa sequenza temporale. Tuttavia, in netto contrasto con gli organi, lo sviluppo degli organoidi è piuttosto eterogeneo.
Oltre alle numerose sfide biologiche6,7, le colture organoidi pongono anche sfide tecnologiche in termini di metodi di coltura cellulare, caratterizzazione della trascrittomica e imaging. Lo sviluppo degli organi in vivo avviene in un ambiente biologico che si traduce in un’auto-organizzazione altamente stereotipata delle disposizioni cellulari. Qualsiasi alterazione fenotipica può essere utilizzata come proxy per diagnosticare uno stato patologico. Al contrario, gli organoidi si sviluppano in vitro in microambienti minimamente controllati compatibili con le condizioni di coltura cellulare, con conseguente grande variabilità nel percorso di sviluppo e nella formazione della forma per ogni singolo organoide.
Un recente studio8 ha dimostrato che l’imaging quantitativo della forma organoide (descrittori fenotipici) accoppiato alla valutazione di alcuni marcatori genetici consente la definizione di paesaggi di sviluppo fenotipici. Probabilmente, la capacità di mettere in relazione la diversità dell’espressione genomica negli organoidi con il loro comportamento fenotipico è un passo importante verso lo sfruttamento del pieno potenziale delle colture organotipiche. Pertanto, richiede lo sviluppo di approcci di imaging dedicati e ad alto contenuto che consentano la caratterizzazione delle caratteristiche organoidi su scale subcellulari, multicellulari e organoidi intere in 3D 9,10.
Abbiamo sviluppato una versatile piattaforma di screening ad alto contenuto (HCS) che consente una coltura organoide semplificata (da cellule staminali embrionali umane isolate [hESC], cellule staminali pluripotenti indotte umane [hIPSC] o cellule primarie a organoidi differenziati 3D, multicellulari) e imaging 3D rapido e non invasivo. Integra un dispositivo di coltura cellulare 3D miniaturizzato di nuova generazione, chiamato chip JeWells (il chip di seguito), che contiene migliaia di micropozzetti ben disposti affiancati da specchi a 45 ° che consentono immagini rapide, 3D e ad alta risoluzione mediante microscopia a foglio di luce a singolo obiettivo11. Compatibile con qualsiasi microscopio invertito standard, commerciale, questo sistema consente l’imaging di 300 organoidi in 3D con risoluzione subcellulare in <1 h.
La microfabbricazione del dispositivo di coltura cellulare parte da uno stampo micro strutturato esistente, che contiene centinaia di micropiramidi (Figura 1A) con base quadrata e pareti laterali a 45° rispetto alla base. La figura 1C mostra le immagini al microscopio elettronico (EM) di tali strutture. Lo stampo stesso è realizzato in poli(dimetilsilossano) (PDMS) e può essere realizzato come un calco replica di uno stampo primario (non mostrato qui) con caratteristiche corrispondenti (come cavità) utilizzando procedure litografiche molli standard. Lo stampo primario può essere prodotto con diverse procedure. Quello utilizzato per questo protocollo è stato realizzato utilizzando l’incisione a umido al silicio come riportato in Galland et al. 11; La procedura per la fabbricazione dello stampo primario non è critica per questo protocollo. Le piramidi sono disposte in una matrice quadrata, con lo stesso passo per le direzioni X e Y (in questo caso il passo è di 350 μm).
A titolo illustrativo, sono stati pubblicati12 esperimenti proof-of-concept per dimostrare che il chip consente una coltura a lungo termine (mesi) e protocolli di differenziazione, definendo con precisione il numero di cellule iniziali nei pozzi. Lo sviluppo individuale di un gran numero di organoidi può essere monitorato automaticamente in tempo reale utilizzando microscopi a fluorescenza standard a campo chiaro e 3D a foglio di luce. Inoltre, gli organoidi possono essere recuperati per eseguire ulteriori indagini biologiche (ad esempio, analisi trascrittomica). Questo documento delinea i protocolli dettagliati per la fabbricazione dei vetrini di copertura della coltura cellulare, la procedura di semina e colorazione per la microscopia a fluorescenza, nonché il recupero degli organoidi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La procedura per la fabbricazione del piatto di coltura a micropozzetto, che consente la coltura e la differenziazione di organoidi ad alta densità, è stata descritta in questo articolo. A causa della geometria e della disposizione delle microcavità, migliaia di sferoidi possono essere coltivati e colorati in una singola piastra per lunghi periodi di tempo (diverse settimane o più) con quasi nessuna perdita di materiale. A titolo di confronto, un’area di 4 mm x 2 mm sulla piastra di coltura cellulare può contenere t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca è supportata dal progetto CALIPSO sostenuto dalla National Research Foundation, Ufficio del Primo Ministro, Singapore, nell’ambito del suo programma Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. riconosce il supporto dello sperimentatore NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding e ANR ADGastrulo. A.B. e G.G. riconoscono il sostegno del finanziamento di base dell’MBI. A.B. riconosce Andor Technologies per il prestito del microscopio BC43.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
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