오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼
Summary
이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.
Abstract
다양한 해상도 스케일에서 다수의 3차원(3D) 유기형 배양(오가노이드)의 특성 분석은 현재 표준 이미징 접근 방식에 의해 제한됩니다. 이 프로토콜은 최소한의 조작으로 최대 300개의 오가노이드/h 이미징 처리량을 지원하는 사용자 친화적인 기기에서 멀티스케일 3D 라이브 이미징을 가능하게 하는 미세 제작된 오가노이드 배양 칩을 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 배양 칩은 공기 및 침지 대물렌즈(공기, 물, 오일 및 실리콘) 및 광범위한 일반 현미경(예: 스피닝 디스크, 포인트 스캐너 공초점, 광시야 및 명시야)과 호환됩니다. 또한 단일 대물렌즈, 단일 평면 조명 현미경(SPIM) 기술(soSPIM)과 같은 라이트 시트 양식과 함께 사용할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 미세가공 배양 칩의 제조와 오가노이드의 배양 및 염색을 위한 자세한 단계를 제공합니다. 익숙해지는 데 짧은 시간 만 필요하며 소모품과 장비는 일반 바이오 실험실에서 쉽게 찾을 수 있습니다. 여기서 3D 이미징 기능은 상용 표준 현미경(예: 3D 재구성을 위한 스피닝 디스크 및 일상적인 모니터링을 위한 광시야 현미경)으로만 시연됩니다.
Introduction
오가노이드라고 하는 유기형 3D 세포 배양에서 줄기세포는 실제 장기와 강력한 형태학적 및 기능적 유사성을 공유하는 공간 구조로 분화하고 자가 조직화됩니다. 오가노이드는 인체 생물학과 신체 외부의 발달을 연구하는 데 유용한 모델을 제공합니다 1,2,3. 간, 뇌, 신장, 폐 및 기타 여러 기관을 모방하는 모델이 점점 더 많이 개발되고 있습니다 2,4,5. 유기체의 분화는 가용성 성장 인자와 세포 외 기질을 정확한 시간 순서로 첨가함으로써 결정됩니다. 그러나, 기관과 현저한 대조적으로, 유기체의 발달은 상당히 이질적이다.
수많은 생물학적 과제6,7 외에도 오가노이드 배양은 세포 배양 방법, 전사체학의 특성화 및 이미징 측면에서 기술적 과제를 제기합니다. 생체내 기관 발달은 세포 배열의 매우 진부한 자기조직을 초래하는 생물학적 환경에서 일어난다. 모든 표현형 변화는 병든 상태를 진단하기위한 대용으로 사용될 수 있습니다. 대조적으로, 오가노이드는 세포 배양 조건과 호환되는 최소한으로 제어되는 미세 환경에서 시험관 내에서 발달하여 각 개별 오가노이드의 발달 경로 및 모양 형성에 큰 변동성을 초래합니다.
최근 연구8는 몇 가지 유전자 마커의 평가와 결합된 오가노이드 모양(표현형 설명자)의 정량적 이미징이 표현형 발달 환경의 정의를 허용한다는 것을 보여주었습니다. 틀림없이, 오가노이드에서 게놈 발현의 다양성을 표현형 행동과 연관시키는 능력은 유기체형 배양의 잠재력을 최대한 발휘하기 위한 주요 단계입니다. 따라서 3D 9,10에서 세포 하, 다세포 및 전체 오가노이드 규모에서 오가노이드 특징을 특성화할 수 있는 전용 고콘텐츠 이미징 접근 방식의 개발이 필요합니다.
당사는 간소화된 오가노이드 배양(분리된 인간 배아 줄기 세포[hESC], 인간 유도 만능 줄기 세포[hIPSC] 또는 일차 세포에서 3D, 다세포, 분화된 오가노이드까지) 및 빠른 비침습적 3D 이미징을 가능하게 하는 다목적 고함량 스크리닝(HCS) 플랫폼을 개발했습니다. JeWells 칩(이하 칩 )이라고 하는 차세대 소형 3D 세포 배양 장치를 통합하고 있으며, 여기에는 단일 대물 라이트 시트 현미경으로 빠른 3D 고해상도 이미징이 가능한 45° 미러 옆에 수천 개의 잘 배열된 마이크로웰이 포함되어있습니다11. 모든 표준 상용 도립 현미경과 호환되는 이 시스템은 300개의 오가노이드를 3D로 이미징할 수 있으며 <1시간 내에 세포하 분해능을 제공합니다.
세포 배양 장치의 미세 가공은 정사각형 베이스와 베이스에 대해 45°의 측벽을 가진 수백 개의 마이크로 피라미드(그림 1A)를 포함하는 기존의 미세 구조화된 몰드에서 시작됩니다. 도 1C는 이러한 구조의 전자 현미경(EM) 이미지를 나타낸다. 금형 자체는 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)로 만들어지며 표준 소프트 리소그래피 절차를 사용하여 해당 기능 (공동)이있는 1 차 금형 (여기에 표시되지 않음)의 복제 주조로 만들 수 있습니다. 기본 금형은 다른 절차로 생산할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 된 것은 Galland 등에보고 된 바와 같이 실리콘 습식 에칭을 사용하여 만들어졌습니다. 11; 1 차 금형 제작 절차는이 프로토콜에 중요하지 않습니다. 피라미드는 X 및 Y 방향에 대해 동일한 피치를 가진 제곱 배열로 배열됩니다 (이 경우 피치는 350μm입니다).
예시로서, 개념 증명 실험(12 )은 칩이 웰의 초기 세포 수를 정확하게 정의하면서 장기 배양(개월) 및 분화 프로토콜을 허용한다는 것을 입증하기 위해 출판되었다. 다수의 오가노이드의 개별 개발은 표준 명시야 및 3D 광시트 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 자동 모니터링할 수 있습니다. 또한, 오가노이드를 검색하여 추가 생물학적 조사(예: 전사체 분석)를 수행할 수 있습니다. 이 백서는 세포 배양 커버슬립 제작, 형광 현미경을 위한 파종 및 염색 절차, 오가노이드 검색에 대한 자세한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
고밀도 오가노이드 배양 및 분화를 허용하는 마이크로웰 배양 접시의 제조 절차가 이 백서에 설명되어 있습니다. 미세 공동의 형상과 배열로 인해 수천 개의 스페로이드를 재료 손실 없이 장기간(몇 주 이상) 동안 단일 플레이트에서 배양하고 염색할 수 있습니다. 비교를 위해 세포 배양 플레이트의 4mm x 2mm 영역에는 면적이 12cm x 8cm인 단일 384웰 플레이트만큼 많은 스페로이드가 포함될 수 있습니?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 싱가포르 총리실의 국립 연구 재단이 지원하는 CALIPSO 프로젝트의 지원을 받아 연구 우수성 및 기술 기업을 위한 캠퍼스(CREATE) 프로그램에 따라 지원됩니다. V.V.는 NRF 조사자 NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI 시드 펀딩 및 ANR ADGastrulo의 지원을 인정합니다. AB와 G.G.는 MBI 핵심 자금의 지원을 인정합니다. A.B.는 BC43 현미경의 대여에 대해 Andor Technologies를 인정합니다.
Materials
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
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