이 논문은 설치류의 안구 미세 해부에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 과정에는 니티팅 멤브레인(즉, 세 번째 눈꺼풀)과 함께 안구의 적출술이 포함됩니다. 그런 다음 후방 안구 컵과 전방 안구 컵을 분리합니다.
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이 논문에서
요약
초록
설치류 눈의 안구 미세 박리는 전방 및 후방 안구를 얻기 위해 부착된 니티팅 막 또는 세 번째 눈꺼풀과 함께 적출된 안구를 분할하는 것을 포함합니다. 이 기술을 사용하면 각막 조직, 신경 조직, 망막 색소 상피(RPE) 조직 및 수정체를 포함한 눈의 하위 부분을 특정 안구 조직의 전체 마운트, 냉동 절개 및/또는 단일 세포 현탁액에 대해 얻을 수 있습니다. 세 번째 눈꺼풀의 존재는 눈의 방향 유지에 도움이 되기 때문에 독특하고 중요한 이점을 제공하며, 이는 국소 개입 후 또는 눈의 공간 지형과 관련된 안구 분석과 관련된 연구에서 눈 생리학을 이해하는 데 중요합니다.
이 방법에서는 외안근을 조심스럽게 천천히 절단하고 시신경을 절단하여 세 번째 눈꺼풀과 함께 소켓의 안구를 적출했습니다. 안구는 마이크로 블레이드를 사용하여 각막 윤부를 관통했습니다. 절개 부위를 진입 지점으로 사용하여 절개 지점을 통해 미세 가위를 삽입하여 각막-공막 접합부를 따라 절단할 수 있었습니다. 컵이 분리될 때까지 원주를 따라 작고 연속적인 절단이 이루어졌습니다. 이들은 신경 망막 및 RPE 층을 얻기 위해 Colibri 봉합 겸자를 사용하여 신경 망막의 반투명 층을 부드럽게 벗겨냄으로써 추가로 해부할 수 있습니다. 또한, 시신경에 도달 할 때까지 주변부에서 시신경에 수직으로 3/4 개의 등거리 절단이 이루어졌습니다. 이렇게 하면 반구형 컵이 작은 꽃 모양으로 열려 평평하게 떨어지고 쉽게 장착할 수 있습니다. 이 기술은 각막 전체 마운트 및 망막 섹션에 대해 실험실에서 사용되었습니다. 세 번째 눈꺼풀의 존재는 비강-측두엽 방향을 묘사하여 이식 후 다양한 세포 치료 개입을 연구할 수 있으므로 이러한 연구에서 시각화 및 정확한 표현에 필수적인 표적 생리학적 검증을 가능하게 합니다.
서론
안구 박리는 안과 연구에서 중요한 기술이며 연구자가 표적 연구를 위해 눈의 부분에 접근할 수 있도록 했습니다. 이전에 안구 연구자들은 연구를 위해 병에 걸린 개인의 안구 조직에 의존했습니다. 그러나, 수년에 걸쳐 점진적으로 증가하는 안과용 설치류 모델1 균주의 수는 인간 안구 조직에 대한 필요성을 감소시켰다. 이러한 마우스 균주는 안구 질환 및 중재에 대한 더 깊은 이해를 가능하게 했습니다. 그러나 그들은 또한 안구 미세 해부의 혁신적인 기술에 대한 필요성을 불러일으켰습니다. 작은 크기와 제한된 작동 영역은 안구 하위 부분에 대한 효과적인 접근을 심각하게 제한합니다. 또한, 후방 및 전방 안구재의 균질한 세포 조립으로 인해 해부 후 표적 중재를 수행하기 어렵습니다. 레이저2 및 외과 미세 해부 3,4의 현재 미세 해부 기술은 안구 연구의 이러한 요구 사항을 충족시키기에 부적절합니다. 레이저 미세 해부는 단일 세포 분석에 매우 효과적이지만 레이저 시술 전에 특정 조직을 미세 해부해야 합니다2. 이 기술은 분자 분석을 위해 사전 해부된 조직에서 작은 관심 영역을 분....
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프로토콜
이 절차는 뉴 델리 국립 면역학 연구소 (National Institute of Immunology)의 기관 동물 윤리위원회 (Institutional Animal Ethics Committee)의 승인을 받았습니다. 승인의 일련 참조 번호는 IAEC#480/18입니다. 실험은 SAF, NII의 전문 수의사의 감독하에 인도 정부 수산, 축산 및 낙농부 동물 실험 통제 및 감독 위원회의 규정 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 준비
- 각 눈에 0.8 % tropicamide와 5 % phenylephrine 점과 용액을 떨어 뜨려 설치류의 눈을 확장시킵니다. 시술 전에 동물을 어두운 곳에 30 분 동안 두십시오.
참고: 동물은 30분을 마친 직후 안락사되므로 진통제가 필요하지 않습니다. 동물의 눈을 어둡게 적응시키고 확장하면 관찰자가 시술 전에 안구 눈물과 손상을 확인할 수 있습니다. 또한, 팽창은 색소 안구 조직으로 작업하는 동안 유리합니다. - 5x 용량의 마취를 복강 내 투여하여 동물을 안락사시킵니다. 일반적인 용량은 10mg의 케타민과 1mg의 자일라진을 포함하는 PBS 200μL입니다.
참고: 동물을 안락사시키기 위한 용량은 400-500mg/kg 체중의 케타민과 5....
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결과
병든 상태의 전방/각막 조직에서 잠재적인 림프 혈관 신생을 연구하기 위해 rd1 마우스 눈/각막 조직의 전체 마운트를 준비했습니다. 세 번째 눈꺼풀에서 부착 된 결막 조직은 각막에 림프관이 없기 때문에 양성 대조군으로 작용했습니다. 연구를 위해 각막 조직을 결막으로 해부하고 4% PFA로 고정한 후 투과화 및 차단했습니다. 그런 다음 조직을 림프 내피 마커(LYVE1)9에 대한 1차 항체로 염색했습니다. 그 후 Alexa Fluor 488(녹색)로 표지된 2차 항체로 인큐베이션했습니다. 대표적인 이미지(그림 4)는 형광 현미경을 사용하여 4x 및 10x에서 캡처되었습니다.
망막 형태학적, 구조적, 기능적 연구를 위해 망막 맥관 구조를 시각화하기 위해 후방 안구재의 신경 망막 전체를 준비했습니다7. 맥락막-RPE 층에서 신경 망막을 조심스럽게 .......
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토론
설치류의 눈은 크기가 작고 구형이기 때문에 안구 미세 해부는 어려운 작업인 것으로 밝혀졌으며, 설치류의 눈은 효율적인 취급을 위한 혁신적인 기술이 필요하다8.
현재 시연된 방법에서, 적출된 마우스 안구는 효과적이고 쉬운 취급을 위해 세 번째 눈꺼풀이 부착된 상태에서 얻어집니다. 세 번째 눈꺼풀을 사용하면 안구를 완전히 고정시킬 수 있으므로 해부를 쉽고 오류를 최소화 할 수 있습니다. 또한, 제 3 눈꺼풀의 존재는 눈의 하위 부분의 방향을 묘사한다. 따라서 안구는 세 번째 눈꺼풀로 해부되어 전방 및 후방 안구를 얻습니다. 균일하고 깨끗한 절단을 허용하기 위해 가위 입구에 슬릿을 사용하면 눈의 구형 특성으로 작업하기가 더 쉬워집니다. 또한, 후방 아이컵을 추가로 해부하여 신경 망막의 반투명 층을 부드럽게 벗겨냄으로써 조직 특이적 연구를 위한 신경 망막 및 RPE 층을 얻을 수 있습니다.
또.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
미국 캘리포니아 데이비스 대학교 세포 생물학 및 인체 해부학과의 Alaknanda Mishra 박사는 뉴델리에 있는 국립 면역학 연구소에서 이 방법을 교육했습니다. 이 작업은 인도 정부의 생명공학부에서 뉴델리의 국립 면역학 연구소(National Institute of Immunology)에 받은 핵심 보조금의 지원을 받았습니다. 추신 : 생명 공학과에서 연구 펠로우쉽을 받았습니다.
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참고문헌
- Choi, Y., et al. Studying cancer immunotherapy using patient-derived xenografts (PDXs) in humanized mice. Experimental and Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Sutherland, C., et al.
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