En metode til undersøgelse af α-synuclein toksicitet og aggregering ved hjælp af en humaniseret gærmodel
Summary
En in vivo fysiologisk model af α-synuclein er nødvendig for at studere og forstå patogenesen af Parkinsons sygdom. Vi beskriver en metode til overvågning af cytotoksicitet og samlet dannelse af α-synuclein ved hjælp af en humaniseret gærmodel.
Abstract
Parkinsons sygdom er den næstmest almindelige neurodegenerative lidelse og er karakteriseret ved progressiv celledød forårsaget af dannelsen af Lewy-kroppe, der indeholder forkert foldede og aggregerede α-synuclein. α-synuclein er et rigeligt præsynaptisk protein, der regulerer synaptisk vesikelhandel, men akkumuleringen af dets proteinholdige indeslutninger resulterer i neurotoksicitet. Nylige undersøgelser har vist, at forskellige genetiske faktorer, herunder bakterielle chaperoner, kan reducere dannelsen af α-synucleinaggregater in vitro. Det er dog også vigtigt at overvåge antiaggregeringseffekten i cellen for at anvende dette som en potentiel behandling for patienterne. Det ville være ideelt at bruge neuronale celler, men disse celler er vanskelige at håndtere og tager lang tid at udvise anti-aggregeringsfænotypen. Der er derfor behov for et hurtigt og effektivt in vivo-værktøj til yderligere evaluering af in vivo-antiaggregeringsaktivitet. Metoden beskrevet her blev brugt til at overvåge og analysere anti-aggregeringsfænotypen i den humaniserede gær Saccharomyces cerevisiae, som udtrykte humant α-synuclein. Denne protokol demonstrerer in vivo-værktøjer, der kan bruges til overvågning af α-synuclein-induceret cellulær toksicitet samt dannelsen af α-synucleinaggregater i celler.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD) er et alvorligt problem for aldrende samfund over hele verden. Aggregeringen af α-synuclein er tæt forbundet med PD, og proteinaggregater af α-synuclein anvendes i vid udstrækning som en molekylær biomarkør til diagnosticering af sygdommen1. α-synuclein er et lille surt protein (140 aminosyrer i længden) med tre domæner, nemlig det N-terminale lipidbindende α-helix, det amyloidbindende centrale domæne (NAC) og den C-terminale sure hale2. Fejlfoldningen af α-synuclein kan forekomme spontant og fører til sidst til dannelsen af amyloidaggregater kaldet Lewy-legemer3. α-synuclein kan bidrage til patogenesen af PD på flere måder. Generelt menes det, at dets unormale, opløselige oligomere former kaldet protofibriller er giftige arter, der forårsager neuronal celledød ved at påvirke forskellige cellulære mål, herunder synaptisk funktion3.
De biologiske modeller, der anvendes til at studere neurodegenerative sygdomme, skal være relevante for mennesker med hensyn til deres genom og cellulære biologi. De bedste modeller ville være menneskelige neuronale cellelinjer. Disse cellelinjer er imidlertid forbundet med flere tekniske problemer, såsom vanskeligheder med vedligeholdelse af kulturer, lav effektivitet af transfektion og høje omkostninger4. Derfor er der behov for et let og pålideligt værktøj til at fremskynde fremskridtene på dette forskningsområde. Det er vigtigt, at værktøjet skal være let at bruge til analyse af de indsamlede data. Fra disse perspektiver er forskellige modelorganismer blevet anvendt i vid udstrækning, herunder Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, gær og gnavere5. Blandt dem er gær den bedste modelorganisme, fordi genetisk manipulation er let, og det er billigere end de andre modelorganismer. Vigtigst er det, at gær har store ligheder med humane celler, såsom 60% sekvenshomologi til humane ortologer og 25% tæt homologi med humane sygdomsrelaterede gener6, og de deler også grundlæggende eukaryot cellebiologi. Gær indeholder mange proteiner med lignende sekvenser og analoge funktioner som dem i humane celler7. Faktisk er gær, der udtrykker menneskelige gener, blevet brugt i vid udstrækning som et modelsystem til at belyse cellulære processer8. Denne gærstamme kaldes humaniseret gær og er et nyttigt værktøj til at udforske funktionen af menneskelige gener9. Humaniseret gær har fortjeneste for at studere genetiske interaktioner, fordi genetisk manipulation er veletableret i gær.
I denne undersøgelse brugte vi gæren Saccharomyces cerevisiae som modelorganisme til at studere patogenesen af PD, især til undersøgelse af dannelse af α-synuclein aggregat og cytotoksicitet10. Til ekspression af α-synuclein i den spirende gær blev W303a-stammen anvendt til transformation med plasmider, der koder for de vildtype- og familiære PD-associerede varianter af α-synuclein. Da W303a-stammen har en auxotrofisk mutation på URA3, er den anvendelig til udvælgelse af celler indeholdende plasmider med URA3. Ekspressionen af α-synuclein kodet i et plasmid reguleres under GAL1-promotoren. Således kan ekspressionsniveauet for α-synuclein styres. Derudover tillader fusionen af grønt fluorescerende protein (GFP) i den C-terminale region af α-synuclein overvågning af dannelsen af α-synucleinfoci. For at forstå egenskaberne ved de familiære PD-associerede varianter af α-synuclein udtrykte vi også disse varianter i gær og undersøgte deres cellulære virkninger. Dette system er et ligetil værktøj til screening af forbindelser eller gener, der udviser beskyttende roller mod cytotoksiciteten af α-synuclein.
Protocol
Representative Results
Discussion
I betragtning af kompleksiteten af forskellige cellulære systemer hos mennesker er det fordelagtigt at anvende gær som model til undersøgelse af humane neurodegenerative sygdomme. Selvom det er næsten umuligt at undersøge de komplekse cellulære interaktioner i den menneskelige hjerne ved hjælp af gær, har gærceller fra et enkeltcelleperspektiv et højt niveau af lighed med humane celler med hensyn til genomisk sekvenshomologi og grundlæggende eukaryote cellulære processer 8,13</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker James Bardwell og Tiago F. Outeiro for venligt at dele plasmiderne indeholdende α-synuclein. Changhan Lee modtog finansiering fra National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af den koreanske regering (MSIT) (tilskud 2021R1C1C1011690), Basic Science Research Program gennem NRF finansieret af Undervisningsministeriet (tilskud 2021R1A6A1A10044950) og den nye fakultetsforskningsfond ved Ajou University.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. . Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson’s disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson’s disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson’s disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson’s Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
