Isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok met behulp van een combinatie van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie

Summary

Het bevorderen van de studie van preantrale folliculogenese vereist efficiënte methoden voor follikelisolatie van enkele eierstokken. Hier wordt een gestroomlijnd, mechanisch protocol gepresenteerd voor follikelisolatie van runderbitussen met behulp van een weefselhakselaar en homogenisator. Deze methode maakt het mogelijk om een groot aantal levensvatbare preantrale follikels uit een enkele eierstok te verzamelen.

Abstract

Het begrijpen van het volledige proces van folliculogenese van zoogdieren is cruciaal voor het verbeteren van geassisteerde voortplantingstechnologieën bij vee, mensen en bedreigde soorten. Onderzoek is meestal beperkt gebleven tot antrale en grote preantrale follikels vanwege moeilijkheden bij de isolatie van kleinere preantrale follikels, vooral bij grote zoogdieren zoals runderen. Dit werk presenteert een efficiënte aanpak om grote aantallen kleine preantrale follikels uit een enkele runder eierstok op te halen. De cortex van individuele runderbitussen werd gesneden in kubussen van 500 μm met behulp van een weefselhakselaar en gedurende 6 minuten gehomogeniseerd bij 9.000-11.000 tpm met behulp van een 10 mm-sonde. Groot puin werd van het homogenaat gescheiden met behulp van een kaasdoek, gevolgd door seriële filtratie door celzeefmachines van 300 μm en 40 μm. De inhoud die in de zeef van 40 μm werd achtergebleven, werd gespoeld in een zoekschaal, waar follikels werden geïdentificeerd en verzameld in een druppel medium. De levensvatbaarheid van de verzamelde follikels werd getest via trypan blue-kleuring. Deze methode maakt de isolatie van een groot aantal levensvatbare kleine preantrale follikels uit een enkele runder eierstok in ongeveer 90 minuten mogelijk. Belangrijk is dat deze methode volledig mechanisch is en het gebruik van enzymen vermijdt om het weefsel te dissociëren, wat de follikels kan beschadigen. De follikels verkregen met behulp van dit protocol kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals isolatie van RNA voor RT-qPCR, immunolokalisatie van specifieke eiwitten en in vitro cultuur.

Introduction

Ovariële follikels zijn de functionele eenheden van de eierstok, verantwoordelijk voor de productie van het gameat (eicel) en hormonen die cruciaal zijn voor de voortplantingsfunctie en de algehele gezondheid. Primordiale follikels vormen zich in de eierstok tijdens de foetale ontwikkeling of in de neonatale periode, afhankelijk van de soort¹, en ze vormen het ovariële reservaat van een vrouw. Folliculaire groei begint met de activering van primordiale follikels die de rustpool verlaten en de groeifase ingaan. Preantrale folliculogenese, die alle follikelstadia vóór de ontwikkeling van het antrum omvat, is een zeer dynamisch proces dat synchrone morfologische en metabole veranderingen in de eicel en de omliggende granulosacellen vereist, aangedreven door nauwe communicatie tussen deze twee celtypen ^2,3. Preantrale follikels vormen de meerderheid van de folliculaire eenheden die op een bepaald moment in de eierstok worden aangetroffen⁴. De ontwikkeling door de preantrale stadia van folliculogenese wordt geschat op enkele weken langer dan antrale ontwikkeling ^5,6, en deze tijd is nodig voor de eicel en somatische cellen om voldoende volwassenheid te verwerven om de laatste fase van ontwikkeling (d.w.z. het antrale stadium) in te gaan en zich voor te bereiden op ovulatie, bevruchting en embryonale ontwikkeling ^7,8,9.

Veel van de huidige kennis over ovariële preantrale folliculogenese komt van muismodellen 10,11,12,13, deels vanwege het gemak bij het herstellen van een groot aantal van deze follikels uit een kleinere en minder vezelige eierstok. Hoewel meldingen van isolatie van grote aantallen preantrale follikels uit runderbieuze eierstokken ongeveer 30 jaar oud zijn¹⁴, is een vollediger begrip van de processen die de ontwikkeling van deze follikels in een vroeg stadium reguleren, niet gerealiseerd, grotendeels vanwege het gebrek aan geoptimaliseerde, efficiënte en herhaalbare methoden om voldoende aantallen levensvatbare preantrale follikels op te halen, vooral in vroege stadia van ontwikkeling. Met de toenemende belangstelling voor het behoud van de ovariële reserve voor toekomstig gebruik bij geassisteerde voortplanting bij mensen, worden koeien een aantrekkelijk model vanwege hun meer vergelijkbare ovariële structuur¹⁵. De runderkolvis is echter aanzienlijk rijker aan collageen in vergelijking met de eierstok van de muis¹⁶, waardoor mechanische isolatie met behulp van methoden die voor de muis zijn beschreven, zeer inefficiënt is. Inspanningen om vruchtbaarheidsbehoudstechnieken uit te breiden omvatten volledige in vitro groei van preantrale follikels tot het antrale stadium, gevolgd door in vitro rijping (IVM) van de ingesloten eicellen, in vitro fertilisatie (IVF) en embryoproductie en -overdracht¹⁷. Tot nu toe is dit hele proces alleen bereikt bij muizen¹⁸. Bij runderen is de vooruitgang in de richting van follikelgroei in vitro beperkt tot enkele rapporten met variabele follikelstadia aan het begin van de kweek, evenals variabele lengte van de cultuur tussen protocollen^17,19.

De in de literatuur beschreven methoden voor de oogst van preantrale follikels uit de runderkolvis hebben meestal mechanische en enzymatische technieken gebruikt, geïsoleerd of in combinatie 2,14,17,20. Het eerste rapport van een protocol voor runderpreantrale follikelisolatie gebruikte een weefselhomogenisator en seriële filtratie om hele eierstokken te verwerken²⁰. Deze studie werd gevolgd door rapporten die mechanische en enzymatische procedures combineerden die collagenase¹⁴ gebruikten. Een terugkerend thema bij het gebruik van collagenase om het eierstokweefsel te verteren, is het potentiële risico op schade aan het folliculaire keldermembraan, wat de levensvatbaarheid van de follikel in gevaar kan brengen 14,21,22,23. Daarom zijn verschillende combinaties van mechanische methoden gebruikt, zoals het gebruik van een weefselhakselaar en herhaald pipetteren of een weefselhakselaar gecombineerd met homogenisatie 20,24,25,26. Een andere mechanische techniek die is beschreven, maakt gebruik van naalden om preantrale follikels rechtstreeks uit het eierstokweefsel te ontleden, wat vooral handig is voor het isoleren van grotere (> 200 μm) secundaire follikels. Dit proces is echter tijdrovend, inefficiënt voor het isoleren van kleinere preantrale follikels en is afhankelijk van vaardigheden wanneer het wordt geprobeerd in runderbieuze eierstokken 19,27,28.

Gebruikmakend van de verschillende technieken die in de literatuur worden beschreven, was dit protocol gericht op het optimaliseren van de isolatie van preantrale follikels uit enkele rundervliegen op een eenvoudige, consistente en efficiënte manier die incubatie in enzymatische oplossingen vermijdt. Het verbeteren van de methoden om preantrale follikels te isoleren zal een kans bieden om het begrip van dit stadium van folliculogenese te vergroten en de ontwikkeling van effectieve kweeksystemen mogelijk te maken om preantrale follikels tot het antrale stadium te ontwikkelen. De gedetailleerde procedures die hierin worden beschreven voor de isolatie van preantrale follikels van een groot zoogdier zoals de rundersoort zullen van vitaal belang zijn voor onderzoekers die vroege folliculogenese willen bestuderen in een niet-muizensoort die vertaalbaar is naar mensen.

Protocol

Runderen (Bos taurus) eierstokken werden afkomstig uit een lokaal slachthuis en binnen 6 uur na het verzamelen naar het laboratorium vervoerd. Vanwege het grote aantal dieren dat in de faciliteit wordt verwerkt, zijn de leeftijd, het ras en het stadium van de oestruscyclus van de dieren onbekend. Omdat er in deze experimenten geen levende dieren werden gebruikt, was een goedgekeurd protocol voor dierverzorging en -gebruik niet vereist. 1. Voorbereiding van apparatuur en reagenti…

Representative Results

Overzicht en kritieke stappenMet behulp van dit protocol kunnen kleine boviene preantrale follikels betrouwbaar worden geïsoleerd uit enkele eierstokken in experimenteel relevante aantallen. Uit een totaal van 30 replicaties werden gemiddeld 41 follikels per replicatie verkregen, met een bereik van 11 tot 135 follikels (figuur 4A). In 14 replicaties werden de follikels gekarakteriseerd voor het stadium van ontwikkeling zoals eerder beschreven26 d…

Discussion

Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare methode om preantrale follikels in een vroeg stadium, met name in primaire en vroege secundaire stadia, uit de runderkolvisus te halen. Dit protocol bouwt voort op eerdere rapporten 20,25,30,34,35,36 en biedt optimalisaties die resulteren in de isolatie van een betekenisvol aantal follikels uit een individuele eierstok.<sup class="x…

Materials

5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette	Duran Wheaton Kimble	63A54	Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining
20 mL Luer-lock Syringe	Fisher Scientific	Z116882-100EA	Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
#21 Sterile Scalpel Blade	Fisher Scientific	50-365-023	Used to cut the ovaries and remove the medula
40 μm Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-547	Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer
104 mm Plastic Funnel	Fisher Scientific	10-348C	Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over
300 μm Cell Strainer	pluriSelect	43-50300-03	Used to filter the filtrate from the cheese cloth
500 mL Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	FB500500	Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth
Air-Tite Sterile Needles 18 G	Thermo Fisher Scientific	14-817-151	18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm	Fisher Scientific	14-817-171	Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck
BD Hoechst 33342 Solution	Fisher Scientific	BDB561908	Fluorescent DNA stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G	Component of follicle wash media
Cheese Cloth	Electron Microscopy Sciences	71748-00	First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris
Classic Double Edge Safety Razor Blades	Wilkinson Sword	N/A	Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Fisher Scientific	A-21206	Secondary antibody for immunostaining
Eisco Latex Pipette Bulbs	Fisher Scientific	S29388	Rubber bulb to use with Pasteur pipettes
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H3375	Component of follicle wash media
Homogenizer	VWR	10032-336	Homogenize the ovarian tissue to release follicles
ImageJ/Fiji	NIH	v2.3.1	Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization
McIlwain Tissue Chopper	Ted Pella	10184	Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization
Microscope – Stereoscope	Olympus	SZX2-ILLT	Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate
Microscope – Inverted	Nikon	Diaphot 300	Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles
Microscope – Inverted	ECHO	Revolve R4	Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M8410-1L	Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching
Non-essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-050	Component of follicle wash medium
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-001	Reagent for immunostaining blocking buffer
Nunc 4-well Dishes for IVF	Thermo Fisher Scientific	144444	4-well dishes for follicle isolation and washing
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Gibco	15-140-122	Component of follicle wash medium
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm	Ted Pella	10184-04	Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP665-1	Washing buffer for ovaries and follicles
Plastic Cutting Board	Fisher Scientific	09-002-24A	Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries
Polyvinylpyrrolidone (PVP)	Fisher Scientific	BP431-100	Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue
Qiagen RNeasy Micro Kit	Qiagen	74004	RNA column clean-up kit
R	The R Foundation	v4.1.2	Statistical analysis software
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody	Abcam	ab181701	Cx37 primary antibody for immunostaining
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691	cDNA synthesis kit
Rstudio	RStudio, PBC	v2021.09.2	Statistical analysis software
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified)	Fisher Scientific	SS266-1	Used to increase media pH to 7.6-7.8
Sodium Pyruvate (NaPyr)	Gibco	11360-070	Component of follicle wash medium
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm	Thermo Fisher Scientific	60872-310	Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725271	Mastermix for PCR reaction
Steritop Threaded Bottle Top Filter	Sigma-Aldrich	S2GPT02RE	Used to sterilize follicle wash medium
SYBR-safe DNA gel stain	Thermo Fisher Scientific	S33102	Staining to visual PCR products on agarose gel
TCM199 with Hank’s Salts	Gibco	12-350-039	Component of follicle wash medium
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergent for immunostaining permeabilization buffer
Trizol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026	RNA isolation reagent
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15-250-061	Used for testing viability of isolated follicles
Tween 20			Detergent for immunostaining wash buffer
Warmer Plate Universal	WTA	20931	Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope
Wiretrol II Calibrated Micropipets	Drummond	50002-005	Glass micropipettes to manipulate follicles