O avanço do estudo da foliculogênese pré-antral requer métodos eficientes de isolamento do folículo a partir de ovários únicos. Apresenta-se aqui um protocolo mecânico simplificado para isolamento folículo de ovários bovinos usando um cortador de tecido e homogeneizador. Este método permite a coleta de um grande número de folículos pré-antrais viáveis de um único ovário.
Compreender todo o processo de foliculogênese de mamíferos é crucial para melhorar as tecnologias de reprodução assistida em gado, humanos e espécies ameaçadas de extinção. A pesquisa tem sido limitada principalmente a folículos pré-antrais grandes e antrais devido à dificuldade no isolamento de folículos pré-antrais menores, especialmente em mamíferos de grande porte, como bovinos. Este trabalho apresenta uma abordagem eficiente para recuperar um grande número de pequenos folículos pré-antrais de um único ovário bovino. O córtex de ovários bovinos individuais foi cortado em cubos de 500 μm usando um helicóptero de tecido e homogeneizado por 6 min a 9.000-11.000 rpm usando uma sonda de 10 mm. Grandes detritos foram separados do homogeneizado com pano de queijo, seguido de filtração seriada através de filtros celulares de 300 μm e 40 μm. O conteúdo retido no filtro de 40 μm foi enxaguado em um prato de busca, onde os folículos foram identificados e coletados em uma gota de meio. A viabilidade dos folículos coletados foi testada por meio da coloração azul de tripano. Este método permite o isolamento de um grande número de pequenos folículos pré-antrais viáveis de um único ovário bovino em aproximadamente 90 min. É importante ressaltar que este método é totalmente mecânico e evita o uso de enzimas para dissociar o tecido, o que pode danificar os folículos. Os folículos obtidos com este protocolo podem ser utilizados para aplicações a jusante, como isolamento de RNA para RT-qPCR, imunolocalização de proteínas específicas e cultura in vitro .
Os folículos ovarianos são as unidades funcionais do ovário, responsáveis pela produção do gameta (ovócito), bem como hormônios críticos para a função reprodutiva e a saúde geral. Os folículos primordiais se formam no ovário durante o desenvolvimento fetal ou no período neonatal, dependendo da espécie1, e constituem a reserva ovariana de uma fêmea. O crescimento folicular começa com a ativação de folículos primordiais que deixam a piscina de repouso e entram na fase de crescimento. A foliculogênese pré-antral, abrangendo todos os estágios do folículo antes do desenvolvimento do antro, é um processo altamente dinâmico que requer alterações morfológicas e metabólicas síncronas no ovócito e nas células granulosas circundantes, impulsionadas pela comunicação estreita entre esses dois tipos celulares 2,3. Os folículos pré-antrais constituem a maioria das unidades foliculares encontradas no ovário em um dado momento4. Estima-se que o desenvolvimento através dos estágios pré-antrais da foliculogênese seja várias semanas maior do que o desenvolvimento antral 5,6, e esse tempo é necessário para que o ovócito e as células somáticas adquiram maturidade suficiente para entrar no estágio final de desenvolvimento (ou seja, o estágio antral) e se preparar para a ovulação, fertilização e desenvolvimento embrionário 7,8,9.
Grande parte do conhecimento atual sobre a foliculogênese pré-antral ovariana vem de modelos de camundongos 10,11,12,13, devido em parte à facilidade em recuperar um grande número desses folículos de um ovário menor e menos fibroso. Embora os relatos de isolamento de um grande número de folículos pré-antrais de ovários bovinos remontem a aproximadamente 30 anos14, uma compreensão mais completa sobre os processos que regulam o desenvolvimento desses folículos em estágio inicial permaneceu não realizada, em grande parte devido à falta de métodos otimizados, eficientes e repetíveis para recuperar um número suficiente de folículos pré-antrais viáveis, particularmente nos estágios iniciais de desenvolvimento. Com o crescente interesse em preservar a reserva ovariana para uso futuro na reprodução assistida em humanos, as vacas tornam-se um modelo atraente devido à sua estrutura ovariana mais semelhante15. No entanto, o ovário bovino é marcadamente mais rico em colágeno em comparação com o ovário de camundongo16, tornando o isolamento mecânico usando métodos descritos para o camundongo muito ineficiente. Os esforços para expandir as técnicas de preservação da fertilidade incluem o crescimento in vitro completo dos folículos pré-antrais até o estágio antral, seguido de maturação in vitro (IVM) dos ovócitos fechados, fertilização in vitro (FIV) e produção e transferência de embriões17. Até agora, todo esse processo só foi alcançado em camundongos18. Em bovinos, o progresso em direção ao crescimento do folículo in vitro é limitado a poucos relatos com estágios folículos variáveis no início da cultura, bem como tempo variável de cultura entre os protocolos17,19.
Os métodos descritos na literatura para a colheita de folículos pré-antrais do ovário bovino têm utilizado principalmente técnicas mecânicas e enzimáticas, isoladas ou em combinação 2,14,17,20. O primeiro relato de um protocolo de isolamento do folículo pré-antral bovino utilizou homogeneizador tecidual e filtração seriada para processar ovários inteiros20. Este estudo foi seguido por relatos que combinaram procedimentos mecânicos e enzimáticos que utilizaram colagenase14. Um tema recorrente na utilização da colagenase para digerir o tecido ovariano é o risco potencial de dano da membrana basal folicular, o que pode comprometer a viabilidade do folículo 14,21,22,23. Portanto, diferentes combinações de métodos mecânicos têm sido empregadas, como o uso de um helicóptero de tecido e pipetagem repetida ou um helicóptero de tecido combinado com homogeneização20,24,25,26. Outra técnica mecânica que foi descrita utiliza agulhas para dissecar folículos pré-antrais diretamente do tecido ovariano, o que é especialmente útil para isolar folículos secundários maiores (>200 μm). No entanto, esse processo é demorado, ineficiente para isolar folículos pré-antrais menores e é dependente de habilidades quando tentado em ovários bovinos 19,27,28.
Aproveitando as diferentes técnicas descritas na literatura, este protocolo teve como objetivo otimizar o isolamento de folículos pré-antrais de ovários bovinos únicos de forma simples, consistente e eficiente, evitando a incubação em soluções enzimáticas. Melhorar os métodos para isolar folículos pré-antrais proporcionará uma oportunidade para melhorar a compreensão deste estágio da foliculogênese e permitir o desenvolvimento de sistemas de cultura eficazes para desenvolver folículos pré-antrais para o estágio antral. Os procedimentos detalhados aqui descritos para o isolamento de folículos pré-antrais de um mamífero de grande porte, como a espécie bovina, serão vitais para os pesquisadores que pretendem estudar a foliculogênese precoce em uma espécie não murina que seja traduzível para os seres humanos.
O presente protocolo detalha um método reprodutível para recuperar folículos pré-antrais em estágio inicial, especificamente nos estágios primário e secundário inicial, do ovário bovino. Este protocolo baseia-se em relatórios anteriores 20,25,30,34,35,36 e fornece otimizações que resultam no isolamento de um número significativo de folículos de um ovário individual.<su…
The authors have nothing to disclose.
Este projeto foi parcialmente financiado pelo projeto multiestadual do USDA W4112 e pelo prêmio UC Davis Jastro Shields à SM.
Os autores gostariam de estender seu apreço à Central Valley Meat, Inc. por fornecer os ovários bovinos usados em todos os experimentos. Os autores também agradecem a Olivia Silvera pela assistência com o processamento do ovário e isolamento do folículo.
5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
#21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
Microscope – Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
Microscope – Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
Microscope – Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |