Et opløseligt tetrazoliumbaseret reduktionsassay for at evaluere virkningen af antistoffer på Candida tropicalis biofilm

Summary

Et 96-brønds mikrotiterpladebaseret protokol ved anvendelse af en 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) reduktionsassay er beskrevet heri for at studere antistoffers virkninger på biofilm dannet af C. tropicalis. Denne in vitro-protokol kan bruges til at kontrollere virkningen af potentielle nye svampedræbende forbindelser på den metaboliske aktivitet af Candida-artsceller i biofilm.

Abstract

Candida arter er den fjerde mest almindelige årsag til systemiske nosokomielle infektioner. Systemisk eller invasiv candidiasis involverer ofte biofilmdannelse på implanterede enheder eller katetre, hvilket er forbundet med øget virulens og dødelighed. Biofilm produceret af forskellige Candida-arter udviser øget resistens over for forskellige svampedræbende stoffer. Derfor er der behov for at udvikle effektive immunterapier eller supplerende behandlinger mod Candida biofilm. Mens rollen som cellulær immunitet er veletableret i anti-Candida-beskyttelse , er rollen som humoral immunitet blevet undersøgt mindre.

Det er blevet antaget, at hæmning af biofilmdannelse og modning er en af de vigtigste funktioner i beskyttende antistoffer, og Candida albicans kimrørantistoffer (CAGTA) har vist sig at undertrykke in vitro-vækst og biofilmdannelse af C. albicans tidligere. Dette papir skitserer en detaljeret protokol til evaluering af antistoffernes rolle på biofilm dannet af C. tropicalis. Metoden til denne protokol involverer C. tropicalis biofilmdannelse i 96-brønds mikrotiterplader, som derefter blev inkuberet i nærvær eller fravær af antigenspecifikke antistoffer efterfulgt af et 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) assay til måling af svampecellernes metaboliske aktivitet i biofilmen.

Specificiteten blev bekræftet ved anvendelse af passende serumkontroller, herunder Sap2-specifikt antistofudtømt serum. Resultaterne viser, at antistoffer til stede i serum af immuniserede dyr kan hæmme Candida biofilm modning in vitro. Sammenfattende giver dette papir vigtig indsigt i antistoffernes potentiale i udviklingen af nye immunterapier og synergistiske eller supplerende behandlinger mod biofilm under invasiv candidiasis. Denne in vitro-protokol kan bruges til at kontrollere virkningen af potentielle nye svampedræbende forbindelser på den metaboliske aktivitet af Candida-artsceller i biofilm.

Introduction

Systemisk candidiasis er den fjerde hovedårsag til nosokomielle infektioner, som er forbundet med høj sygelighed og dødelighed på verdensplan. Globalt påvirker systemisk candidiasis ca. 700.000 individer¹. Candida-arter, nemlig C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata og C. auris, er den mest almindelige årsag til invasive Candida-infektioner ². Candida-arter er opportunistiske patogener, der producerer biofilm³. Biofilm er overvejende forbundet med Candida virulens, og Candida kan modstå oxidative og osmotiske stresstilstande ved at inducere biofilmdannelse⁴. Biofilm modulerer yderligere ekspressionen af virulensfaktorer og cellevægskomponenter og danner en exopolymer beskyttelsesmatrix, der hjælper Candida med at tilpasse sig forskellige værtsnicher⁴. Biofilm bidrager til gærbinding på værtsvæv og medicinske instrumenter⁵. Som sådan er biofilmdannelse forbundet med en fordel for gær, da gærceller i biofilmene kan undgå værtsimmunresponset⁶. Biofilmdannelse beskytter også de patogene gær mod virkningen af svampedræbende stoffer⁵. Nedsat modtagelighed af C. albicans biofilm til amphotericin B er blevet påvist af Pierce et ^al.7,8. Desuden viser biofilm svampedræbende lægemiddelresistens over for fluconazol, hvilket forringer effektiv behandling af systemisk candidiasis ^9,10.

Mikrober har en iboende tendens til at klæbe til forskellige biotiske og abiotiske overflader, hvilket resulterer i biofilmdannelse. Candida albicans, som er en dimorf svamp, findes i gær- og hyphalformer, og dens biofilmdannelse er blevet karakteriseret i forskellige in vitro- og in vivo-modelsystemer ¹¹. Trinene til biofilmdannelse inkluderer vedhæftning af Candida-celler til substratet, filamentering, proliferation og biofilmmodning¹¹. Indledningsvis klæber gærformen af C. albicans til substrater, herunder medicinsk udstyr og humant væv, efterfulgt af filamentering og spredning af C. albicans i hyphal- og pseudohyphalformer og endelig modning af biofilm indlejret i ekstracellulær matrix¹¹. Biofilmdannelse bidrager i vid udstrækning til C. albicans patogenesemekanismer¹². Candida-arter danner lægemiddelresistente biofilm, hvilket gør deres udryddelse udfordrende¹³. En lille delmængde af den biofilmproducerende population C. albicans er blevet beskrevet som værende meget resistent over for de svampedræbende stoffer amphotericin B og chlorhexidin¹⁴. Det skal bemærkes, at gærceller i biofilm udviser høj modstandsdygtighed over for multidrugbehandling sammenlignet med gærceller i planktonfasen og spredningsfase¹⁴. Det er blevet foreslået, at gærceller, der findes i biofilm, er meget tolerante over for svampedræbende stoffer, hvilket bidrager til C. albicans overlevelse i biofilm¹⁴. Disse eksisterende celler blev rapporteret at være fænotypiske varianter af C. albicans og ikke mutanter¹⁴. Desuden er celler i Candida biofilm kendt som “persisterceller” tolerante over for høje doser af amphotericin-B-behandling og bidrager til Candida-overlevelse og udgør derved en stor byrde af tilbagevendende systemiske Candida-infektioner hos højrisikopersoner¹⁵.

Stigningen i svampedræbende lægemiddelresistens i Candida-stammer nødvendiggør forskning i nye svampedræbende midler og immunterapier. Som det fremgår af ovennævnte undersøgelser, viser Candida biofilm nedsat modtagelighed for svampedræbende stoffer. Derfor er der behov for forbedrede immunterapier til at kontrollere Candida biofilm dannelse. Tidligere undersøgelser har vist, at CAGTA kan yde effektiv beskyttelse mod systemiske Candida-infektioner ved at hæmme dannelsen af C. albicans biofilm in vitro¹⁶. En anden undersøgelse rapporterede, at immunisering af mus med C. albicans rAls3-N protein inducerer høje antistoftitre, der forstyrrer C. albicans biofilmdannelse in vitro¹⁷. Anti-Als3-N antistoffer udøvede også en hæmmende virkning på C. albicans spredning fra biofilm¹⁷. NDV-3A-vaccine baseret på C. albicans er i øjeblikket under klinisk forsøg, og anti-NDV-3A-sera viste sig også at reducere C. auris biofilmdannelse¹⁸. En nylig undersøgelse identificerede hæmning af biofilmdannelse af Sap2-antistoffer som en beskyttelsesmekanisme i en murinmodel af systemisk candidiasis¹⁹.

Dette papir skitserer en detaljeret in vitro-protokol til evaluering af effekten af antigenspecifikke antistoffer til stede i polyklonalt serum opnået fra forskellige grupper af Sap2-vaccinerede mus på præformerede Candida tropicalis-biofilm . For at opnå dette blev en metode baseret på et XTT-reduktionsassay optimeret og udviklet i laboratoriet, som kan måle biofilmlevedygtighed på en hurtig, følsom og høj kapacitet måde i nærvær eller fravær af antistoffer.

XTT-analysen bruges til at måle cellulær metabolisk aktivitet som en indikator for cellelevedygtighed, cellulær proliferation og cytotoksicitet²⁰. Dette kolorimetriske assay er baseret på reduktionen af et gult tetrazoliumsalt, natrium 3′-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzensulfonssyrehydrat (XTT) til et orange formazanfarvestof af metabolisk aktive celler. Da kun levedygtige celler kan reducere XTT, er mængden af reduceret XTT-formazan proportional med intensiteten af farve og cellelevedygtighed. Det dannede formazanfarvestof er vandopløseligt og kvantificeres direkte ved hjælp af en pladelæser. På grund af sin vandopløselige natur tillader XTT-analysen undersøgelsen af intakte biofilm samt undersøgelse af biofilmlægemiddelfølsomhed uden forstyrrelse af biofilmstruktur²¹. Derudover er denne metode implementeret i Candida svampelevedygtighedsvurderinger på grund af dens brugervenlighed, hastighed, nøjagtighed, høje gennemstrømning og høje grad af reproducerbarhed ^7,22.

Ud over XTT-reduktionsanalysen er der også identificeret adskillige alternative teknikker til måling af biofilmmængde. Nogle af disse inkluderer brugen af MTT-reduktionsassay, krystalviolet farvning, DNA-kvantificering, kvantitativ PCR, proteinkvantificering, måling af tørcellevægt og levedygtig kolonitælling. Disse procedurer varierer meget med hensyn til deres tids- og omkostningskrav. Taff et al. udførte en sammenlignende analyse af syv forskellige Candida biofilmkvantitetsanalyser og fandt ud af, at XTT-analysen gav den mest reproducerbare, nøjagtige og effektive metode til kvantitativ estimering af C. albicans biofilm²³. Farvningsteknikker såsom krystalviolet har visse begrænsninger; Den krystalviolette test bestemmer indirekte mængden af biofilm ved at måle den optiske tæthed af den krystalvioletfarvede biofilmmatrix og celler. Selvom det krystalviolette assay giver et godt mål for biofilmmasse, giver det ikke et mål for biofilmlevedygtighed, da det pletter både mikrobielle celler og den ekstracellulære matrix²⁴. Dhale et al. rapporterede yderligere, at XTT-reduktionsanalysen var den mest følsomme, reproducerbare, nøjagtige, effektive og specifikke metode til at detektere biofilmproduktion sammenlignet med krystalviolet assay²⁵. Litteraturrapporter har vist, at XTT-analysen korrelerer godt med CFU/ml-parameteren i CFU-tællemetoden. Sammenlignet med XTT-analysen er CFU-metoden imidlertid arbejdskrævende og langsom²⁶. Desuden er fraktionen af fritliggende levende celler muligvis ikke repræsentativ for den oprindelige biofilmpopulation²⁷. Selvom XTT-reduktionsanalysen synes at være den bedste tilgængelige mulighed for at kvantificere levedygtigheden, er der et par begrænsninger ved denne teknik. Mens XTT-metoden er nyttig til sammenligninger, der involverer en svampestamme, kan dens anvendelse være begrænset, når man sammenligner forskellige svampestammer og arter. Interstrain sammenligninger kan være vanskelige i mangel af detaljeret standardisering, da forskellige stammer metaboliserer substrater med forskellige muligheder²¹.

Protocol

BALB/c mus blev opstaldet i Small Animal Facility på IIT Roorkee. Alle dyr blev holdt i en 12 timer: 12 h lys: mørk cyklus ved 25 ° C og blev forsynet med en pellet kost og vand ad libitum. Alle dyreforsøg blev godkendt af IIT Roorkees institutionelle dyreetiske komité (IAEC). 1. Fremstilling af C. tropicalis BEMÆRK: Svampen Candida tropicalis tilhører risikogruppe 2 patogener og er klassificeret som en BSL2 mikroorga…

Representative Results

Candida tropicalis biofilm blev dyrket i 96-brønds mikrotiterplader og afbildet ved 40x ved hjælp af et omvendt mikroskop (figur 1A). Biofilmen blev yderligere farvet ved hjælp af krystalviolet og observeret ved 40x ved hjælp af et omvendt mikroskop (figur 1B). Scanning elektronmikroskopi viser et repræsentativt billede af C. tropicalis biofilm (figur 1C). Til udførelse af biofilmhæmningsanalysen blev 10<sup…

Discussion

Svampeinfektioner forårsaget af Candida-arter er forbundet med høj sygelighed og dødelighed over hele verden. Den voksende trussel om invasiv svampeinfektion kræver tidlig håndtering af sådanne livstruende sygdomme. De fleste Candida-infektioner involverer dannelse af biofilm, som klæber til en række medicinske anordninger og er ansvarlige for persistens og gentagelse af svampeinfektioner i hospitalsmiljøer³¹. Biofilm består af gær- eller hyphalceller, og de udviser be…

Materials

15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	–	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	–	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493