Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

Summary

Een 96-well microtiter plaat-gebaseerd protocol met behulp van een 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reductietest wordt hierin beschreven, om de effecten van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis te bestuderen. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Abstract

Candida-soorten zijn de vierde meest voorkomende oorzaak van systemische nosocomiale infecties. Systemische of invasieve candidiasis omvat vaak biofilmvorming op geïmplanteerde apparaten of katheters, wat geassocieerd is met verhoogde virulentie en mortaliteit. Biofilms geproduceerd door verschillende Candida-soorten vertonen een verhoogde weerstand tegen verschillende antischimmelmiddelen. Daarom is het nodig om effectieve immunotherapieën of aanvullende behandelingen tegen Candida-biofilms te ontwikkelen. Hoewel de rol van cellulaire immuniteit goed is ingeburgerd bij anti-Candida-bescherming, is de rol van humorale immuniteit minder bestudeerd.

Er is verondersteld dat remming van biofilmvorming en rijping een van de belangrijkste functies van beschermende antilichamen is, en Candida albicans kiembuisantistoffen (CAGTA) hebben aangetoond dat ze in vitro groei en biofilmvorming van C. albicans eerder onderdrukken. Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het evalueren van de rol van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis. De methodologie voor dit protocol omvat C. tropicalis biofilmvorming in 96-well microtiter platen, die vervolgens werden geïncubeerd in de aan- of afwezigheid van antigeen-specifieke antilichamen, gevolgd door een 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) test voor het meten van de metabole activiteit van schimmelcellen in de biofilm.

De specificiteit werd bevestigd door het gebruik van geschikte serumcontroles, waaronder Sap2-specifiek antilichaam-uitgeput serum. De resultaten tonen aan dat antilichamen in het serum van geïmmuniseerde dieren de rijping van candida-biofilm in vitro kunnen remmen. Samenvattend biedt dit artikel belangrijke inzichten met betrekking tot het potentieel van antilichamen bij het ontwikkelen van nieuwe immunotherapieën en synergetische of aanvullende behandelingen tegen biofilms tijdens invasieve candidiasis. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Introduction

Systemische candidiasis is de vierde belangrijke oorzaak van nosocomiale infecties, die wereldwijd worden geassocieerd met hoge morbiditeits- en sterftecijfers. Wereldwijd treft systemische candidiasis ongeveer 700.000 personen¹. Candida-soorten, namelijk C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata en C. auris, zijn de meest voorkomende oorzaak van invasieve Candida-infecties ². Candida-soorten zijn opportunistische pathogenen die biofilms produceren³. Biofilms worden voornamelijk geassocieerd met Candida virulentie, en Candida kan bestand zijn tegen oxidatieve en osmotische stressomstandigheden door biofilmvorming te induceren⁴. Biofilms moduleren verder de expressie van virulentiefactoren en celwandcomponenten en vormen een exopolymere beschermende matrix, waardoor Candida zich kan aanpassen aan verschillende gastheerniches⁴. Biofilms dragen bij tot de hechting van gist op gastheerweefsels en medische instrumenten⁵. Als zodanig is biofilmvorming geassocieerd met een voordeel voor gisten, omdat gistcellen in de biofilms de immuunrespons van de gastheer kunnen ontwijken⁶. Biofilmvorming beschermt ook de pathogene gisten tegen de werking van antischimmelmiddelen⁵. Verminderde gevoeligheid van C. albicans biofilms voor amfotericine B is aangetoond door Pierce et ^al.7,8. Bovendien tonen biofilms antischimmelresistentie tegen fluconazol, wat een effectief beheer van systemische candidiasis schaadt ^9,10.

Microben hebben een intrinsieke neiging om zich te hechten aan verschillende biotische en abiotische oppervlakken, wat resulteert in biofilmvorming. Candida albicans, een dimorfe schimmel, komt voor in gist- en hyphale vormen en de biofilmvorming ervan is gekarakteriseerd in verschillende in vitro en in vivo modelsystemen¹¹. De stappen van biofilmvorming omvatten de hechting van Candida-cellen aan het substraat, filamentatie, proliferatie en biofilmrijping¹¹. Aanvankelijk hecht de gistvorm van C. albicans zich aan substraten, waaronder medische hulpmiddelen en menselijk weefsel, gevolgd door filamentatie en proliferatie van C. albicans in hyphale en pseudohyphale vormen, en ten slotte rijping van biofilms ingebed in extracellulaire matrix¹¹. Biofilmvorming draagt grotendeels bij aan C. albicans pathogenese mechanismen¹². Candida-soorten vormen resistente biofilms, waardoor hun uitroeiing uitdagend^{is 13}. Een kleine subgroep van de C. albicans biofilmproducerende populatie is beschreven als zeer resistent tegen de antischimmelmiddelen amfotericine B en chloorhexidine¹⁴. Van belang is dat gistcellen in biofilms een hoge weerstand vertonen tegen multidrugtherapie in vergelijking met gistcellen in de planktonfase en proliferatiefase¹⁴. Er is gesuggereerd dat gistcellen in biofilms zeer tolerant zijn voor antischimmelmiddelen, wat bijdraagt aan de overleving van C. albicans in biofilms¹⁴. Deze bestaande cellen waren fenotypische varianten van C. albicans en geen mutanten¹⁴. Bovendien zijn cellen van Candida-biofilms die bekend staan als “persistercellen” tolerant voor hoge doses amfotericine-B-behandeling en dragen ze bij aan de overleving van Candida, waardoor ze een grote last vormen van terugkerende systemische Candida-infecties bij personen met een hoog risico¹⁵.

De toename van antischimmelresistentie bij Candida-stammen vereist onderzoek naar nieuwe antischimmelmiddelen en immunotherapieën. Zoals blijkt uit de bovengenoemde studies, tonen Candida-biofilms een verminderde gevoeligheid voor antischimmelmiddelen. Daarom is er behoefte aan verbeterde immunotherapieën om candida biofilmvorming onder controle te houden. Eerdere studies hebben aangetoond dat CAGTA effectieve bescherming kan bieden tegen systemische Candida-infecties door de vorming van C. albicans biofilm in vitro^{te remmen 16}. Een andere studie meldde dat immunisatie van muizen met C. albicans rAls3-N-eiwit hoge antilichaamtiters induceert die interfereren met de vorming van C. albicans biofilm in vitro¹⁷. Anti-Als3-N antilichamen oefenden ook een remmend effect uit op C. albicans dispersie uit biofilms¹⁷. NDV-3A-vaccin op basis van C. albicans wordt momenteel klinisch getest en anti-NDV-3A-sera bleken ook de vorming van C. auris-biofilm te verminderen¹⁸. Een recente studie identificeerde remming van biofilmvorming door Sap2-antilichamen als een beschermingsmechanisme in een muizenmodel van systemische candidiasis¹⁹.

Dit artikel schetst een gedetailleerd in vitro protocol voor het evalueren van het effect van antigeenspecifieke antilichamen aanwezig in polyklonaal serum verkregen uit verschillende groepen Sap2-gevaccineerde muizen op voorgevormde Candida tropicalis-biofilms . Om dit te bereiken, werd een methode op basis van een XTT-reductietest geoptimaliseerd en ontwikkeld in het laboratorium, die de levensvatbaarheid van biofilm op een snelle, gevoelige en high-throughput manier kan meten, in de aan- of afwezigheid van antilichamen.

De XTT-test wordt gebruikt om cellulaire metabole activiteit te meten als een indicator van de levensvatbaarheid van cellen, cellulaire proliferatie en cytotoxiciteit²⁰. Deze colorimetrische test is gebaseerd op de reductie van een geel tetrazoliumzout, natrium 3′-[1-(fenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzeensulfonzuurhydraat (XTT) tot een oranje formazankleurstof door metabolisch actieve cellen. Omdat alleen levensvatbare cellen XTT kunnen verminderen, is de hoeveelheid verminderde XTT-formazan evenredig met de intensiteit van kleur en levensvatbaarheid van cellen. De gevormde formazankleurstof is wateroplosbaar en wordt direct gekwantificeerd met behulp van een plaatlezer. Vanwege de in water oplosbare aard maakt de XTT-test de studie van intacte biofilms mogelijk, evenals het onderzoek van de gevoeligheid van biofilmgeneesmiddelen, zonder verstoring van de biofilmstructuur²¹. Bovendien wordt deze methode geïmplementeerd in Candida schimmel levensvatbaarheid beoordelingen vanwege het gebruiksgemak, snelheid, nauwkeurigheid, hoge doorvoer en hoge mate van reproduceerbaarheid ^7,22.

Naast de XTT-reductietest zijn er ook tal van alternatieve technieken geïdentificeerd voor het meten van de hoeveelheid biofilm. Sommige hiervan omvatten het gebruik van de MTT-reductietest, kristalvioletkleuring, DNA-kwantificering, kwantitatieve PCR, eiwitkwantificering, droge celgewichtmeting en levensvatbare kolonietelling. Deze procedures variëren sterk in termen van hun tijd- en kostenvereisten. Taff et al. voerden een vergelijkende analyse uit van zeven verschillende Candida biofilm quantitatie assays en vonden dat de XTT assay de meest reproduceerbare, nauwkeurige en efficiënte methode leverde voor de kwantitatieve schatting van C. albicans biofilms²³. Kleuringstechnieken zoals kristalviolet hebben bepaalde beperkingen; de kristalviolettest bepaalt indirect de hoeveelheid biofilm door de optische dichtheid van de met kristalvioleten gekleurde biofilmmatrix en cellen te meten. Hoewel de kristalviolettest een goede maat voor de biofilmmassa biedt, geeft het geen maat voor de levensvatbaarheid van de biofilm, omdat het zowel microbiële cellen als de extracellulaire matrix^{kleurt 24}. Dhale et al. rapporteerden verder dat de XTT-reductietest de meest gevoelige, reproduceerbare, nauwkeurige, efficiënte en specifieke methode was om biofilmproductie te detecteren in vergelijking met kristalviolettest²⁵. Literatuurrapporten hebben aangetoond dat de XTT-test goed correleert met de CFU / ml-parameter in de CFU-telmethode. In vergelijking met de XTT-test is de CFU-methode echter arbeidsintensief en traag²⁶. Bovendien is de fractie van losse levende cellen mogelijk niet representatief voor de initiële biofilmpopulatie²⁷. Hoewel de XTT-reductietest de best beschikbare optie lijkt om de levensvatbaarheid te kwantificeren, zijn er een paar beperkingen van deze techniek. Hoewel de XTT-methode nuttig is voor vergelijkingen met één schimmelstam, kan het gebruik ervan beperkt zijn bij het vergelijken van verschillende schimmelstammen en soorten. Interstrain-vergelijkingen kunnen moeilijk zijn bij gebrek aan gedetailleerde standaardisatie, omdat verschillende stammen substraten metaboliseren met verschillende mogelijkheden²¹.

Protocol

BALB/c muizen werden ondergebracht in de Small Animal Facility bij IIT Roorkee. Alle dieren werden gehouden in een 12 h:12 h licht:donker cyclus bij 25 °C en werden voorzien van een pelletdieet en water ad libitum. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) van IIT Roorkee. 1. Bereiding van C. tropicalis OPMERKING: De schimmel Candida tropicalis behoort tot de pathogenen van ri…

Representative Results

Candida tropicalis biofilms werden gekweekt in 96-well microtiter platen en in beeld gebracht op 40x met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1A). De biofilm werd verder gekleurd met kristalviolet en waargenomen bij 40x met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1B). Scanning elektronenmicroscopie toont een representatief beeld van C. tropicalis biofilm (figuur 1C). Voor het uitvoeren van de biofilm r…

Discussion

Schimmelinfecties veroorzaakt door Candida-soorten worden geassocieerd met hoge morbiditeits- en sterftecijfers wereldwijd. De groeiende dreiging van invasieve schimmelinfectie vereist het vroege beheer van dergelijke levensbedreigende ziekten. De meeste Candida-infecties omvatten de vorming van biofilms, die zich hechten aan een verscheidenheid aan medische hulpmiddelen en verantwoordelijk zijn voor de persistentie en herhaling van schimmelinfecties in ziekenhuisomgevingen³¹. Bi…

Materials

15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	–	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	–	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493