Essai de réduction soluble à base de tétrazolium pour évaluer l’effet des anticorps sur les biofilms de Candida tropicalis

Summary

Un protocole à base de plaques de microtitrage à 96 puits utilisant un test de réduction du 2,3-bis(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-5-carboxanilide-2H-tétrazolium (XTT) est décrit ici, pour étudier les effets des anticorps sur les biofilms formés par C. tropicalis. Ce protocole in vitro peut être utilisé pour vérifier l’effet de nouveaux composés antifongiques potentiels sur l’activité métabolique des cellules de l’espèce Candida dans les biofilms.

Abstract

Les espèces de Candida sont la quatrième cause la plus fréquente d’infections nosocomiales systémiques. La candidose systémique ou invasive implique souvent la formation de biofilm sur des dispositifs implantés ou des cathéters, ce qui est associé à une virulence et une mortalité accrues. Les biofilms produits par différentes espèces de Candida présentent une résistance accrue contre divers médicaments antifongiques. Par conséquent, il est nécessaire de développer des immunothérapies efficaces ou des traitements d’appoint contre les biofilms de Candida . Alors que le rôle de l’immunité cellulaire est bien établi dans la protection anti-Candida , le rôle de l’immunité humorale a été moins étudié.

On a émis l’hypothèse que l’inhibition de la formation et de la maturation du biofilm est l’une des principales fonctions des anticorps protecteurs, et il a été démontré que les anticorps du tube germal de Candida albicans (CAGTA) suppriment la croissance in vitro et la formation de biofilm de C. albicans plus tôt. Cet article décrit un protocole détaillé pour évaluer le rôle des anticorps sur les biofilms formés par C. tropicalis. La méthodologie de ce protocole implique la formation de biofilm de C. tropicalis dans des plaques de microtitrage à 96 puits, qui ont ensuite été incubées en présence ou en l’absence d’anticorps spécifiques de l’antigène, suivie d’un test de 2,3-bis(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-5-carboxanilide-2H-tétrazolium (XTT) pour mesurer l’activité métabolique des cellules fongiques dans le biofilm.

La spécificité a été confirmée en utilisant des témoins sériques appropriés, y compris un sérum appauvri en anticorps spécifiques de Sap2. Les résultats démontrent que les anticorps présents dans le sérum des animaux immunisés peuvent inhiber la maturation du biofilm de Candida in vitro. En résumé, cet article fournit des informations importantes sur le potentiel des anticorps dans le développement de nouvelles immunothérapies et de traitements synergiques ou d’appoint contre les biofilms au cours de la candidose invasive. Ce protocole in vitro peut être utilisé pour vérifier l’effet de nouveaux composés antifongiques potentiels sur l’activité métabolique des cellules de l’espèce Candida dans les biofilms.

Introduction

La candidose systémique est la quatrième cause majeure d’infections nosocomiales, qui sont associées à des taux élevés de morbidité et de mortalité dans le monde entier. À l’échelle mondiale, la candidose systémique touche environ 700 000 personnes¹. Les espèces de Candida, à savoir C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata et C. auris, sont la cause la plus fréquente d’infections invasives à Candida ². Les espèces de Candida sont des pathogènes opportunistes qui produisent des biofilms³. Les biofilms sont principalement associés à la virulence de Candida, et Candida peut résister à des conditions de stress oxydatif et osmotique en induisant la formation de biofilm⁴. Les biofilms modulent davantage l’expression des facteurs de virulence et des composants de la paroi cellulaire et forment une matrice protectrice exopolymère, aidant Candida à s’adapter à différentes niches hôtes⁴. Les biofilms contribuent à l’adhérence des levures sur les tissus de l’hôte et les instruments médicaux⁵. En tant que telle, la formation de biofilm est associée à un avantage pour les levures, car les cellules de levure dans les biofilms peuvent échapper à la réponse immunitaire de l’hôte⁶. La formation de biofilm protège également les levures pathogènes de l’action des médicaments antifongiques⁵. Pierce et coll.7,8 ont démontré une diminution de la sensibilité des biofilms de C. albicans à l’amphotéricine B. ^7,8. De plus, les biofilms démontrent une résistance aux médicaments antifongiques au fluconazole, ce qui nuit à la prise en charge efficace de la candidose systémique ^9,10.

Les microbes ont une tendance intrinsèque à adhérer à diverses surfaces biotiques et abiotiques, ce qui entraîne la formation de biofilm. Candida albicans, qui est un champignon dimorphe, existe sous forme de levure et d’hyphes, et sa formation de biofilm a été caractérisée dans divers systèmes modèles in vitro et in vivo ¹¹. Les étapes de la formation du biofilm comprennent l’adhésion des cellules Candida au substrat, la filamentation, la prolifération et la maturation du biofilm¹¹. Initialement, la forme de levure de C. albicans adhère aux substrats, y compris les dispositifs médicaux et les tissus humains, suivie par la filamentation et la prolifération de C. albicans en formes hyphales et pseudohyphes, et enfin la maturation des biofilms intégrés dans la matrice extracellulaire¹¹. La formation de biofilm contribue largement aux mécanismes de pathogenèse de C. albicans ¹². Les espèces de Candida forment des biofilms résistants aux médicaments, ce qui rend leur éradication difficile¹³. Un petit sous-ensemble de la population productrice de biofilm de C. albicans a été décrit comme étant très résistant aux médicaments antifongiques amphotéricine B et chlorhexidine¹⁴. Il convient de noter que les cellules de levure dans les biofilms présentent une résistance élevée à la multithérapie par rapport aux cellules de levure en phase planctonique et en phase^{de prolifération 14}. Il a été suggéré que les cellules de levure existant dans les biofilms sont très tolérantes aux médicaments antifongiques, ce qui contribue à la survie de C. albicans dans les biofilms¹⁴. Ces cellules existantes ont été signalées comme étant des variantes phénotypiques de C. albicans et non des mutants¹⁴. En outre, les cellules des biofilms de Candida connues sous le nom de « cellules persistantes » sont tolérantes à de fortes doses de traitement à l’amphotéricine-B et contribuent à la survie de Candida, ce qui représente un lourd fardeau d’infections systémiques récurrentes à Candida chez les personnes à haut risque¹⁵.

L’augmentation de la résistance aux médicaments antifongiques dans les souches de Candida nécessite la recherche de nouveaux agents antifongiques et d’immunothérapies. Comme le montrent les études susmentionnées, les biofilms de Candida montrent une sensibilité réduite aux médicaments antifongiques. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer les immunothérapies pour contrôler la formation de biofilm de Candida. Des études antérieures ont montré que CAGTA peut fournir une protection efficace contre les infections systémiques à Candida en inhibant la formation de biofilm de C. albicans in vitro¹⁶. Une autre étude a rapporté que l’immunisation de souris avec la protéine RAls3-N de C. albicans induit des titres élevés d’anticorps qui interfèrent avec la formation du biofilm de C. albicans in vitro¹⁷. Les anticorps anti-Als3-N ont également exercé un effet inhibiteur sur la dispersion de C. albicans à partir de biofilms¹⁷. Le vaccin NDV-3A à base de C. albicans fait actuellement l’objet d’essais cliniques et des sérums anti-NDV-3A ont également permis de réduire la formation de biofilm de C. auris ¹⁸. Une étude récente a identifié l’inhibition de la formation de biofilm par les anticorps Sap2 comme mécanisme de protection dans un modèle murin de candidose systémique¹⁹.

Cet article décrit un protocole in vitro détaillé pour évaluer l’effet des anticorps spécifiques de l’antigène présents dans le sérum polyclonal obtenu à partir de différents groupes de souris vaccinées Sap2 sur des biofilms préformés de Candida tropicalis . Pour ce faire, une méthode basée sur un test de réduction XTT a été optimisée et développée en laboratoire, qui peut mesurer la viabilité du biofilm de manière rapide, sensible et à haut débit, en présence ou en l’absence d’anticorps.

Le test XTT est utilisé pour mesurer l’activité métabolique cellulaire en tant qu’indicateur de viabilité cellulaire, de prolifération cellulaire et de cytotoxicité²⁰. Ce dosage colorimétrique est basé sur la réduction d’un sel de tétrazolium jaune, l’hydrate d’acide benzène sulfonique (XTT) 3′-[1-(phénylaminocarbonyl)-3,4-tétrazolium]-bis (4-méthoxy-6-nitro)benzène sulfonique (XTT) de sodium en un colorant formazan orange par des cellules métaboliquement actives. Étant donné que seules les cellules viables peuvent réduire la XTT, la quantité de formazan XTT réduite est proportionnelle à l’intensité de la couleur et à la viabilité cellulaire. Le colorant formazan formé est soluble dans l’eau et est directement quantifié à l’aide d’un lecteur de plaques. En raison de sa nature soluble dans l’eau, le test XTT permet l’étude de biofilms intacts, ainsi que l’examen de la sensibilité aux médicaments du biofilm, sans perturbation de la structure du biofilm²¹. De plus, cette méthode est mise en œuvre dans les évaluations de viabilité fongique de Candida en raison de sa facilité d’utilisation, de sa vitesse, de sa précision, de son débit élevé et de son haut degré de reproductibilité ^7,22.

En plus du test de réduction XTT, de nombreuses techniques alternatives ont également été identifiées pour la mesure de la quantité de biofilm. Certains d’entre eux comprennent l’utilisation du test de réduction MTT, la coloration au violet cristallin, la quantification de l’ADN, la PCR quantitative, la quantification des protéines, la mesure du poids des cellules sèches et le comptage des colonies viables. Ces procédures varient considérablement en termes de temps et de coûts. Taff et al. ont effectué une analyse comparative de sept tests différents de quantification du biofilm de Candida et ont constaté que le test XTT fournissait la méthode la plus reproductible, précise et efficace pour l’estimation quantitative des biofilms de C. albicans ²³. Les techniques de coloration telles que le cristal violet ont certaines limites; Le test du violet cristallin détermine indirectement la quantité de biofilm en mesurant la densité optique de la matrice et des cellules de biofilm colorées au violet cristallin. Bien que le test du cristal violet fournisse une bonne mesure de la masse du biofilm, il ne donne pas une mesure de la viabilité du biofilm car il colore à la fois les cellules microbiennes et la matrice extracellulaire²⁴. Dhale et coll. ont en outre indiqué que le test de réduction XTT était la méthode la plus sensible, reproductible, précise, efficace et spécifique pour détecter la production de biofilm par rapport au test de violet^{cristallin 25}. Les rapports de littérature ont montré que le test XTT est bien corrélé avec le paramètre UFC/mL dans la méthode de comptage CFU. Cependant, par rapport au test XTT, la méthode CFU est laborieuse et lente²⁶. De plus, la fraction de cellules vivantes détachées peut ne pas être représentative de la population initiale de biofilms²⁷. Bien que le test de réduction XTT semble la meilleure option disponible pour quantifier la viabilité, cette technique présente quelques limites. Bien que la méthode XTT soit utile pour les comparaisons impliquant une souche fongique, son utilisation peut être limitée lors de la comparaison de différentes souches et espèces fongiques. Les comparaisons entre souches peuvent être difficiles en l’absence d’une normalisation détaillée, car différentes souches métabolisent des substrats ayant des capacités différentes²¹.

Protocol

Les souris BALB/c ont été logées dans l’installation pour petits animaux de l’IIT Roorkee. Tous les animaux ont été maintenus dans un cycle lumière:obscurité de 12 h:12 h à 25 °C et ont reçu un régime de granulés et de l’eau ad libitum. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel d’éthique animale (IAEC) de l’IIT Roorkee. 1. Préparation de C. tropicalis REMA…

Representative Results

Les biofilms de Candida tropicalis ont été cultivés dans des plaques de microtitrage à 96 puits et imagés à 40x à l’aide d’un microscope inversé (Figure 1A). Le biofilm a ensuite été coloré à l’aide de cristal violet et observé à 40x à l’aide d’un microscope inversé (Figure 1B). La microscopie électronique à balayage montre une image représentative du biofilm de C. tropicalis (Figure 1C…

Discussion

Les infections fongiques causées par les espèces de Candida sont associées à des taux élevés de morbidité et de mortalité dans le monde entier. La menace croissante d’une infection fongique invasive nécessite la prise en charge précoce de ces maladies potentiellement mortelles. La plupart des infections à Candida impliquent la formation de biofilms, qui adhèrent à une variété de dispositifs médicaux et sont responsables de la persistance et de la récurrence des infections fongiques en…

Materials

15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	–	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	–	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493