Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf Candida tropicalis-Biofilme
Summary
Ein 96-Well-Mikrotiterplatten-basiertes Protokoll unter Verwendung eines 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Reduktionstests wird hierin beschrieben, um die Auswirkungen von Antikörpern auf Biofilme zu untersuchen, die von C. tropicalis gebildet werden. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.
Abstract
Candida-Arten sind die vierthäufigste Ursache für systemische nosokomiale Infektionen. Die systemische oder invasive Candidiasis beinhaltet häufig die Bildung von Biofilmen auf implantierten Geräten oder Kathetern, was mit einer erhöhten Virulenz und Mortalität einhergeht. Biofilme, die von verschiedenen Candida-Arten produziert werden, zeigen eine erhöhte Resistenz gegen verschiedene Antimykotika. Daher besteht die Notwendigkeit, wirksame Immuntherapien oder Zusatzbehandlungen gegen Candida-Biofilme zu entwickeln. Während die Rolle der zellulären Immunität im Anti-Candida-Schutz gut etabliert ist, wurde die Rolle der humoralen Immunität weniger untersucht.
Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Hemmung der Biofilmbildung und -reifung eine der Hauptfunktionen schützender Antikörper ist, und Candida albicans Keimrohrantikörper (CAGTA) haben gezeigt, dass sie das In-vitro-Wachstum und die Biofilmbildung von C. albicans früher unterdrücken. Dieser Artikel skizziert ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der Rolle von Antikörpern auf Biofilmen, die von C. tropicalis gebildet werden. Die Methodik für dieses Protokoll beinhaltet die C. tropicalis-Biofilmbildung in 96-Well-Mikrotiterplatten, die dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen-spezifischen Antikörpern inkubiert wurden, gefolgt von einem 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Assay zur Messung der metabolischen Aktivität von Pilzzellen im Biofilm.
Die Spezifität wurde durch geeignete Serumkontrollen, einschließlich Sap2-spezifischem Antikörper-depleted Serum, bestätigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die im Serum immunisierter Tiere vorhanden sind, die Candida-Biofilmreifung in vitro hemmen können. Zusammenfassend liefert dieser Artikel wichtige Erkenntnisse über das Potenzial von Antikörpern bei der Entwicklung neuartiger Immuntherapien und synergistischer oder ergänzender Behandlungen gegen Biofilme während der invasiven Candidiasis. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.
Introduction
Die systemische Candidiasis ist die vierte Hauptursache für nosokomiale Infektionen, die weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten einhergehen. Weltweit betrifft die systemische Candidiasis etwa 700.000 Personen1. Candida-Arten, nämlich C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata und C. auris, sind die häufigste Ursache für invasive Candida-Infektionen 2. Candida-Arten sind opportunistische Krankheitserreger, die Biofilme produzieren3. Biofilme sind überwiegend mit Candida-Virulenz assoziiert, und Candida kann oxidativen und osmotischen Stressbedingungen standhalten, indem es die Biofilmbildung induziert4. Biofilme modulieren die Expression von Virulenzfaktoren und Zellwandkomponenten weiter und bilden eine exopolymere Schutzmatrix, die Candida hilft, sich an verschiedene Wirtsnischen anzupassen4. Biofilme tragen zur Hefehaftung auf Wirtsgewebe und medizinischen Instrumenten bei5. Daher ist die Biofilmbildung mit einem Vorteil für Hefen verbunden, da Hefezellen innerhalb der Biofilme der Immunantwort des Wirts ausweichen können6. Die Biofilmbildung schützt auch die pathogenen Hefen vor der Wirkung von Antimykotika5. Eine verminderte Empfindlichkeit von C. albicans-Biofilmen gegenüber Amphotericin B wurde von Pierce et al.7,8 nachgewiesen. Darüber hinaus zeigen Biofilme eine antimykotische Arzneimittelresistenz gegen Fluconazol, was die effektive Behandlung der systemischen Candidiasis beeinträchtigt 9,10.
Mikroben haben eine intrinsische Tendenz, an verschiedenen biotischen und abiotischen Oberflächen zu haften, was zur Biofilmbildung führt. Candida albicans, ein dimorpher Pilz, existiert in Hefe- und Hyphenformen, und seine Biofilmbildung wurde in verschiedenen in vitro und in vivo Modellsystemen charakterisiert11. Die Schritte der Biofilmbildung umfassen die Adhäsion von Candida-Zellen am Substrat, die Filamentierung, die Proliferation und die Biofilmreifung11. Zunächst haftet die Hefeform von C. albicans an Substraten, einschließlich medizinischer Geräte und menschlichem Gewebe, gefolgt von der Filamentierung und Proliferation von C. albicans in Hyphen- und Pseudohyphalformen und schließlich der Reifung von Biofilmen, die in die extrazelluläre Matrix11 eingebettet sind. Die Biofilmbildung trägt wesentlich zu den Pathogenesemechanismen von C. albicans bei12. Candida-Arten bilden arzneimittelresistente Biofilme, was ihre Ausrottung schwierig macht13. Eine kleine Untergruppe der C. albicans-Biofilm-produzierenden Population wurde als sehr resistent gegen die Antimykotika Amphotericin B und Chlorhexidin14 beschrieben. Bemerkenswert ist, dass Hefezellen in Biofilmen im Vergleich zu Hefezellen in der Planktonphase und Proliferationsphase14 eine hohe Resistenz gegen Multidrug-Therapie aufweisen. Es wurde vorgeschlagen, dass Hefezellen, die in Biofilmen vorhanden sind, sehr tolerant gegenüber Antimykotika sind, was zum Überleben von C. albicans in Biofilmen beiträgt14. Es wurde berichtet, dass diese vorhandenen Zellen phänotypische Varianten von C. albicans und keine Mutanten sind14. Darüber hinaus sind Zellen von Candida-Biofilmen, die als “Persister-Zellen” bekannt sind, tolerant gegenüber hohen Dosen der Amphotericin-B-Behandlung und tragen zum Überleben von Candida bei, wodurch eine große Belastung durch wiederkehrende systemische Candida-Infektionen bei Hochrisikopersonen darstellt15.
Die Zunahme der antimykotischen Arzneimittelresistenz bei Candida-Stämmen erfordert die Erforschung neuer Antimykotika und Immuntherapien. Wie aus den oben genannten Studien hervorgeht, zeigen Candida-Biofilme eine verminderte Anfälligkeit für Antimykotika. Daher besteht ein Bedarf an verbesserten Immuntherapien, um die Bildung von Candida-Biofilmen zu kontrollieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass CAGTA einen wirksamen Schutz vor systemischen Candida-Infektionen bieten kann, indem es die Biofilmbildung von C. albicans in vitrohemmt 16. Eine andere Studie berichtete, dass die Immunisierung von Mäusen mit C. albicans rAls3-N-Protein hohe Antikörpertiter induziert, die die Biofilmbildung von C. albicans in vitro17 stören. Anti-Als3-N-Antikörper übten auch eine hemmende Wirkung auf die Ausbreitung von C. albicans aus Biofilmenaus 17. Der NDV-3A-Impfstoff auf Basis von C. albicans befindet sich derzeit in der klinischen Prüfung und es wurde auch festgestellt, dass Anti-NDV-3A-Seren die Biofilmbildung von C. auris reduzieren18. Eine kürzlich durchgeführte Studie identifizierte die Hemmung der Biofilmbildung durch Sap2-Antikörper als Schutzmechanismus in einem murinen Modell der systemischen Candidiasis19.
Dieser Artikel skizziert ein detailliertes In-vitro-Protokoll zur Bewertung der Wirkung von antigenspezifischen Antikörpern, die in polyklonalem Serum aus verschiedenen Gruppen von Sap2-geimpften Mäusen auf vorgeformten Candida tropicalis-Biofilmen vorhanden sind. Um dies zu erreichen, wurde eine auf einem XTT-Reduktionsassay basierende Methode optimiert und im Labor entwickelt, die die Biofilmlebensfähigkeit schnell, empfindlich und mit hohem Durchsatz in Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern messen kann.
Der XTT-Assay wird verwendet, um die zelluläre Stoffwechselaktivität als Indikator für Zelllebensfähigkeit, Zellproliferation und Zytotoxizität zu messen20. Dieser kolorimetrische Assay basiert auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumsalzes, Natrium 3′-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzolsulfonsäurehydrat (XTT) zu einem orangefarbenen Formazanfarbstoff durch metabolisch aktive Zellen. Da nur lebensfähige Zellen XTT reduzieren können, ist die Menge an reduziertem XTT-Formazan proportional zur Intensität der Farbe und Zelllebensfähigkeit. Der gebildete Formazan-Farbstoff ist wasserlöslich und wird direkt mit einem Plattenleser quantifiziert. Aufgrund seiner wasserlöslichen Natur ermöglicht der XTT-Assay die Untersuchung intakter Biofilme sowie die Untersuchung der Empfindlichkeit von Biofilmarzneimitteln ohne Störung der Biofilmstruktur21. Darüber hinaus wird diese Methode aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Geschwindigkeit, Genauigkeit, ihres hohen Durchsatzes und ihres hohen Reproduzierbarkeitsgrades in Candida-Pilzlebensfähigkeitsbewertungen implementiert 7,22.
Neben dem XTT-Reduktionstest wurden auch zahlreiche alternative Techniken zur Messung der Biofilmmenge identifiziert. Einige davon umfassen die Verwendung des MTT-Reduktionsassays, die Kristallviolettfärbung, die DNA-Quantifizierung, die quantitative PCR, die Proteinquantifizierung, die Messung des Trockenzellgewichts und die Zählung lebensfähiger Kolonien. Diese Verfahren unterscheiden sich stark in Bezug auf ihren Zeit- und Kostenaufwand. Taff et al. führten eine vergleichende Analyse von sieben verschiedenen Candida-Biofilm-Quantifizierungsassays durch und stellten fest, dass der XTT-Assay die reproduzierbarste, genaueste und effizienteste Methode für die quantitative Schätzung von C. albicans-Biofilmen darstellte23. Färbetechniken wie Kristallviolett haben bestimmte Einschränkungen; Der Kristallvioletttest bestimmt indirekt die Menge an Biofilm, indem er die optische Dichte der kristallviolett gefärbten Biofilmmatrix und -zellen misst. Obwohl der kristallviolette Assay ein gutes Maß für die Biofilmmasse liefert, gibt er kein Maß für die Biofilmlebensfähigkeit, da er sowohl mikrobielle Zellen als auch die extrazelluläre Matrix färbt24. Dhale et al. berichteten weiter, dass der XTT-Reduktionstest die empfindlichste, reproduzierbarste, genaueste, effizienteste und spezifischste Methode zum Nachweis der Biofilmproduktion im Vergleich zum kristallvioletten Assay25 war. Literaturberichte haben gezeigt, dass der XTT-Assay gut mit dem CFU/mL-Parameter in der CFU-Zählmethode korreliert. Im Vergleich zum XTT-Assay ist die CFU-Methode jedoch arbeitsintensiv und langsam26. Darüber hinaus ist der Anteil abgelöster lebender Zellen möglicherweise nicht repräsentativ für die ursprüngliche Biofilmpopulation27. Obwohl der XTT-Reduktionstest die beste verfügbare Option zur Quantifizierung der Lebensfähigkeit zu sein scheint, gibt es einige Einschränkungen dieser Technik. Während die XTT-Methode für Vergleiche mit einem Pilzstamm nützlich ist, kann ihre Verwendung beim Vergleich verschiedener Pilzstämme und -arten begrenzt sein. Vergleiche zwischen Stämmen können ohne detaillierte Standardisierung schwierig sein, da verschiedene Stämme Substrate mit unterschiedlichen Fähigkeiten metabolisieren21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pilzinfektionen, die durch Candida-Arten verursacht werden, sind weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten verbunden. Die wachsende Bedrohung durch invasive Pilzinfektionen erfordert die frühzeitige Behandlung solcher lebensbedrohlichen Erkrankungen. Die meisten Candida-Infektionen beinhalten die Bildung von Biofilmen, die an einer Vielzahl von Medizinprodukten haften und für die Persistenz und das Wiederauftreten von Pilzinfektionen in Krankenhäusern verantwortlich sind<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Ramalingaswami-Stipendium DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) und den Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Government of India) an S.R. Die Autoren erkennen einen ICMR-JRF-Zuschuss an P.C. und DBT-JRF-Zuschuss an P.S. Die Autoren danken Dr. Ravikant Ranjan für die Vorschläge zum Manuskript und die technische Unterstützung durch Herrn Pradeep Singh Thakur während des SEM.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | – | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
| 96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
| Incubator | Generic | ||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate Reader | Generic | ||
| Multichannel pipette and tips | Generic | ||
| Petri dishes | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactate | – | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
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