בדיקת הפחתה מסיסה המבוססת על טטרזוליום להערכת השפעת נוגדנים על ביופילמים של קנדידה טרופיקליס

Summary

פרוטוקול מבוסס צלחת מיקרוטיטר 96-well המשתמש ב-2,3-ביס(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-5-קרבוקסילייד-2H-tetrazolium (XTT) מתואר כאן, כדי לחקור את השפעת הנוגדנים על ביופילמים שנוצרו על ידי C. tropicalis. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים.

Abstract

מיני קנדידה הם הגורם הרביעי בשכיחותו לזיהומים נוסוקומיאליים מערכתיים. קנדידה מערכתית או פולשנית כרוכה לעתים קרובות בהיווצרות ביופילם במכשירים מושתלים או בצנתרים, הקשורה לעלייה באלימות ובתמותה. ביופילמים המיוצרים על ידי זני קנדידה שונים מפגינים עמידות משופרת נגד תרופות אנטי פטרייתיות שונות. לכן, יש צורך לפתח אימונותרפיות יעילות או טיפולים משלימים נגד ביופילמים של קנדידה. בעוד שתפקיד החסינות התאית מבוסס היטב בהגנה נגד קנדידה, תפקידה של חסינות הומורלית נחקר פחות.

הועלתה השערה כי עיכוב היווצרות ביופילם והבשלתו הוא אחד התפקידים העיקריים של נוגדנים מגנים, ונוגדנים של צינוריות חיידקים קנדידה אלביקנס (CAGTA) הוכחו כמדכאים צמיחה במבחנה והיווצרות ביופילם של C. albicans מוקדם יותר. מאמר זה מתווה פרוטוקול מפורט להערכת תפקידם של נוגדנים על ביופילמים שנוצרו על ידי C. tropicalis. המתודולוגיה של פרוטוקול זה כוללת היווצרות ביופילם C. tropicalis בלוחות מיקרוטיטרים בעלי 96 בארות, אשר לאחר מכן דוגרו בנוכחות או בהיעדר נוגדנים ספציפיים לאנטיגן, ולאחר מכן 2,3-ביס(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-5-קרבוקסניליד-2H-tetrazolium (XTT) למדידת הפעילות המטבולית של תאים פטרייתיים בביופילם.

הספציפיות אושרה על ידי שימוש בבקרות מתאימות בסרום, כולל סרום מדולדל בנוגדנים ספציפיים ל-Sap2. התוצאות מראות כי נוגדנים הנמצאים בסרום של בעלי חיים מחוסנים יכולים לעכב את הבשלת הביופילם של קנדידה במבחנה. לסיכום, מאמר זה מספק תובנות חשובות לגבי הפוטנציאל של נוגדנים בפיתוח אימונותרפיות חדשניות וטיפולים סינרגטיים או משלימים נגד ביופילמים במהלך קנדידה פולשנית. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים.

Introduction

קנדידה מערכתית היא הגורם העיקרי הרביעי לזיהומים נוסוקומיאליים, הקשורים לשיעורי תחלואה ותמותה גבוהים ברחבי העולם. ברחבי העולם, קנדידה מערכתית משפיעה על כ 700,000 אנשים¹. מיני קנדידה, כלומר C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, ו- C. auris, הם הגורם השכיח ביותר לזיהומים פולשניים בקנדידה ². מיני קנדידה הם פתוגנים אופורטוניסטיים המייצרים ביופילמים³. ביופילמים קשורים בעיקר לאלימות של קנדידה, וקנדידה יכולה לעמוד בתנאי עקה חמצוניים ואוסמוטיים על ידי גרימת היווצרות ביופילם⁴. ביופילמים מווסתים עוד יותר את הביטוי של גורמי אלימות ורכיבי דופן התא ויוצרים מטריצת הגנה אקסופולימרית, המסייעת לקנדידה להסתגל לנישות מארחות שונות⁴. ביופילמים תורמים להיצמדות השמרים ברקמות המארחות ובמכשירים רפואיים⁵. ככזה, יצירת ביופילם קשורה ליתרון לשמרים, שכן תאי שמרים בתוך הביופילמים יכולים לחמוק מהתגובה החיסונית של המארח⁶. היווצרות ביופילם גם מגנה על השמרים הפתוגניים מפני פעולה של תרופות אנטי פטרייתיות⁵. ירידה ברגישות של ביופילמים של C. albicans לאמפוטריצין B הודגמה על ידי Pierce et ^al.7,8. יתר על כן, ביופילמים מדגימים עמידות של תרופה אנטי-פטרייתית לפלוקונזול, מה שפוגע בניהול יעיל של קנדידה סיסטמית ^9,10.

למיקרובים יש נטייה פנימית להיצמד למשטחים ביוטיים וא-ביוטיים שונים, מה שמביא להיווצרות ביופילם. קנדידה אלביקנס, שהיא פטרייה דימורפית, קיימת בצורות שמרים והיפאלים, והיווצרות הביופילם שלה אופיינה במערכות שונות במבחנה ובמודל in vivo ¹¹. השלבים של היווצרות ביופילם כוללים הידבקות של תאי קנדידה למצע, נימה, שגשוג והבשלת ביופילם¹¹. בתחילה, צורת השמרים של C. albicans נצמדת למצעים, כולל מכשירים רפואיים ורקמות אנושיות, ולאחר מכן נימה והתפשטות של C. albicans לצורות hyphal ו pseudohyphal, ולבסוף התבגרות של ביופילמים מוטבע מטריצה חוץ-תאית¹¹. היווצרות ביופילם תורמת במידה רבה למנגנוני הפתוגנזה של C. albicans ¹². מיני קנדידה יוצרים ביופילמים עמידים לתרופות, מה שהופך את חיסולם למאתגר¹³. תת-קבוצה קטנה של אוכלוסיית ייצור הביופילם C. albicans תוארה כבעלת עמידות גבוהה לתרופות האנטי-פטרייתיות אמפוטריצין B וכלורהקסידין¹⁴. יש לציין כי תאי שמרים בביופילמים מפגינים עמידות גבוהה לטיפול רב-תכליתי בהשוואה לתאי שמרים בשלב הפלנקטוני ובשלב ההתרבות¹⁴. הוצע כי תאי שמרים הקיימים בביופילמים עמידים מאוד לתרופות אנטי פטרייתיות, מה שתורם להישרדות C. albicans בביופילמים¹⁴. תאים קיימים אלה דווחו כגרסאות פנוטיפיות של C. albicans ולא מוטנטים¹⁴. יתר על כן, תאים של ביופילמים של קנדידה המכונים “תאים מתמידים” סובלניים למינונים גבוהים של טיפול באמפוטריצין-B ותורמים להישרדות הקנדידה, ובכך מהווים נטל גדול של זיהומי קנדידה סיסטמיים חוזרים ונשנים אצל אנשים בסיכון גבוה¹⁵.

העלייה בעמידות לתרופות אנטי-פטרייתיות בזני קנדידה מחייבת מחקר עבור חומרים אנטי-פטרייתיים ואימונותרפיות חדשים. כפי שניתן לראות מהמחקרים שהוזכרו לעיל, ביופילמים של קנדידה מראים ירידה ברגישות לתרופות אנטי פטרייתיות. לכן, יש צורך באימונותרפיות משופרות כדי לשלוט בהיווצרות הביופילם של קנדידה. מחקרים קודמים הראו כי CAGTA יכול לספק הגנה יעילה מפני זיהומים סיסטמיים של קנדידה על ידי עיכוב היווצרות ביופילם של C. albicans במבחנה¹⁶. מחקר אחר דיווח כי חיסון של עכברים עם חלבון C. albicans rAls3-N משרה רמות נוגדנים גבוהות שמפריעות להיווצרות ביופילם של C. albicans במבחנה¹⁷. נוגדנים נגד Als3-N הפעילו גם השפעה מעכבת על פיזור C. albicans מביופילמים¹⁷. חיסון NDV-3A המבוסס על C. albicans נמצא כעת בניסוי קליני ונגד NDV-3A sera נמצאו גם כמפחיתים את היווצרות הביופילם C. auris ¹⁸. מחקר שנערך לאחרונה זיהה עיכוב של היווצרות ביופילם על ידי נוגדנים Sap2 כמנגנון הגנה במודל מורין של קנדידה מערכתית¹⁹.

מאמר זה מתווה פרוטוקול מבחנה מפורט להערכת ההשפעה של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן הנמצאים בסרום פוליקלונלי המתקבל מקבוצות שונות של עכברים מחוסנים ב-Sap2 על ביופילמים מוכנים מראש של קנדידה טרופיקליס . כדי להשיג זאת, שיטה המבוססת על בדיקת הפחתת XTT עברה אופטימיזציה ופותחה במעבדה, שיכולה למדוד את כדאיות הביופילם באופן מהיר, רגיש ובעל תפוקה גבוהה, בנוכחות או בהיעדר נוגדנים.

מבחן XTT משמש למדידת הפעילות המטבולית של התאים כאינדיקטור לכדאיות התאים, התפשטות התאים וציטוטוקסיות²⁰. בדיקה קולורימטרית זו מבוססת על הפחתה של מלח טטרזוליום צהוב, נתרן 3′-[1-(פנילאמינוקרוניל)-3,4-טטרזוליום]-ביס (4-מתוקסי-6-ניטרו) בנזן חומצה סולפונית הידרט (XTT) לצבע פורמאזן כתום על ידי תאים פעילים מטבולית. מכיוון שרק תאים בני קיימא יכולים להפחית XTT, כמות הפורמאזן המופחתת של XTT פרופורציונלית לעוצמת הצבע ולכדאיות התא. הצבע הפורמזני שנוצר מסיס במים ומכמת אותו ישירות באמצעות קורא צלחות. בשל אופיו המסיס במים, מבחן XTT מאפשר לחקור ביופילמים שלמים, כמו גם בדיקה של רגישות לתרופות ביופילם, ללא הפרעה למבנה הביופילם²¹. בנוסף, שיטה זו מיושמת בהערכות כדאיות פטרייתיות של קנדידה בשל קלות השימוש, המהירות, הדיוק, התפוקה הגבוהה והרמה הגבוהה של יכולת השחזור ^7,22.

בנוסף לבדיקת הפחתת XTT, זוהו גם טכניקות חלופיות רבות למדידת כמות הביופילם. חלקם כוללים שימוש בבדיקת הפחתת MTT, צביעת סגול גבישי, כימות DNA, PCR כמותי, כימות חלבונים, מדידת משקל תא יבש וספירת מושבות בת קיימא. נהלים אלה משתנים מאוד מבחינת דרישות הזמן והעלות שלהם. Taff et al. ביצעו ניתוח השוואתי של שבעה מבחני כמות שונים של קנדידה ביופילם ומצאו כי בדיקת XTT סיפקה את השיטה הניתנת לשחזור, מדויקת ויעילה ביותר להערכה כמותית של ביופילמים של C. albicans ²³. טכניקות צביעה כגון סגול קריסטל יש מגבלות מסוימות; בדיקת סגול הגביש קובעת בעקיפין את כמות הביופילם על ידי מדידת הצפיפות האופטית של מטריצת הביופילם והתאים המוכתמים בסגול. אף על פי שהבדיקה הסגולה הגבישית מספקת מדידה טובה של מסת הביופילם, היא אינה נותנת מדד לכדאיות הביופילם מכיוון שהיא מכתימה הן את התאים המיקרוביאליים והן את המטריצה החוץ-תאית²⁴. Dhale et al. דיווחו עוד כי בדיקת הפחתת XTT הייתה השיטה הרגישה, הניתנת לשחזור, המדויקת, היעילה והספציפית ביותר לזיהוי ייצור ביופילם בהשוואה למבחן סגול גבישי²⁵. דוחות ספרות הראו כי בדיקת XTT מתואמת היטב עם פרמטר CFU/mL בשיטת ספירת CFU. עם זאת, בהשוואה למבחן XTT, שיטת CFU היא עתירת עבודה ואיטית²⁶. יתר על כן, ייתכן שהחלק של תאים חיים מנותקים אינו מייצג את אוכלוסיית הביופילם הראשונית²⁷. למרות שבדיקת הפחתת XTT נראית כאפשרות הטובה ביותר הזמינה לכימות הכדאיות, ישנן כמה מגבלות של טכניקה זו. בעוד ששיטת XTT שימושית להשוואות הכוללות זן פטרייתי אחד, השימוש בה עשוי להיות מוגבל כאשר משווים זנים ומינים פטרייתיים שונים. השוואות בין-גזעיות עשויות להיות קשות בהיעדר סטנדרטיזציה מפורטת מכיוון שזנים שונים מעכלים מצעים בעלי יכולות שונות²¹.

Protocol

עכברי BALB/c שוכנו במתקן החיות הקטן ב- IIT Roorkee. כל בעלי החיים הוחזקו במחזור אור:חושך של 12 שעות:12 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס וסופקו להם דיאטת גלולות ומים עד ליביטום. כל ההליכים למען בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לאתיקה של בעלי חיים (IAEC) של IIT Roorkee. 1. הכנת C. tropica…

Representative Results

הביופילמים של קנדידה טרופיקליס גודלו בלוחות מיקרוטיטרים של 96 בארות והצטלמו לפי 40 באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1A). הביופילם הוכתם עוד יותר באמצעות סיגלית גבישית ונצפה פי 40 באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1B). מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת מראה תמונה מייצגת …

Discussion

זיהומים פטרייתיים הנגרמים על ידי זני קנדידה קשורים לשיעורי תחלואה ותמותה גבוהים ברחבי העולם. האיום הגובר של זיהום פטרייתי פולשני מחייב ניהול מוקדם של מחלות מסכנות חיים כאלה. רוב זיהומי הקנדידה כרוכים בהיווצרות ביופילמים, אשר דבקים במגוון מכשירים רפואיים ואחראים להתמדה ולהישנו…

Materials

15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	–	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	–	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493