कैंडिडा ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म पर एंटीबॉडी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक घुलनशील टेट्राज़ोलियम-आधारित कमी परख
Summary
सी ट्रॉपिकलिस द्वारा गठित बायोफिल्म पर एंटीबॉडी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, 2,3-बीआईएस (2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो-5-सल्फोफिनाइल)-5-कार्बोक्सनिलाइड-2एच-टेट्राज़ोलियम (एक्सटीटी) कमी परख का उपयोग करके एक 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेट-आधारित प्रोटोकॉल यहां वर्णित है। इस इन विट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग बायोफिल्म में कैंडिडा प्रजातियों की कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि पर संभावित नए एंटिफंगल यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
Abstract
कैंडिडा प्रजातियां प्रणालीगत नोसोकोमियल संक्रमण का चौथा सबसे आम कारण हैं। प्रणालीगत या आक्रामक कैंडिडिआसिस में अक्सर प्रत्यारोपित उपकरणों या कैथेटर पर बायोफिल्म गठन शामिल होता है, जो बढ़ी हुई उग्रता और मृत्यु दर से जुड़ा होता है। विभिन्न कैंडिडा प्रजातियों द्वारा उत्पादित बायोफिल्म विभिन्न एंटिफंगल दवाओं के खिलाफ बढ़े हुए प्रतिरोध का प्रदर्शन करते हैं। इसलिए, कैंडिडा बायोफिल्म के खिलाफ प्रभावी इम्यूनोथेरेपी या सहायक उपचार विकसित करने की आवश्यकता है। जबकि एंटी-कैंडिडा संरक्षण में सेलुलर प्रतिरक्षा की भूमिका अच्छी तरह से स्थापित है, ह्यूमर इम्युनिटी की भूमिका का कम अध्ययन किया गया है।
यह अनुमान लगाया गया है कि बायोफिल्म गठन और परिपक्वता का निषेध सुरक्षात्मक एंटीबॉडी के प्रमुख कार्यों में से एक है, और कैंडिडा अल्बिकन्स जर्म ट्यूब एंटीबॉडी (सीएजीटीए) को पहले सी अल्बिकन्स के इन विट्रो विकास और बायोफिल्म गठन को दबाने के लिए दिखाया गया है। यह पेपर सी ट्रॉपिकलिस द्वारा गठित बायोफिल्म पर एंटीबॉडी की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है। इस प्रोटोकॉल की कार्यप्रणाली में 96-वेल माइक्रोटिटर प्लेटों में सी ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म गठन शामिल है, जिसे तब एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में इनक्यूबेट किया गया था, इसके बाद बायोफिल्म में फंगल कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि को मापने के लिए 2,3-बीआईएस (2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रो-5-सल्फोफिनाइल) -5-कार्बोक्सनिलाइड-2एच-टेट्राज़ोलियम (एक्सटीटी) परख शामिल थी।
उपयुक्त सीरम नियंत्रणों का उपयोग करके विशिष्टता की पुष्टि की गई, जिसमें एसएपी 2-विशिष्ट एंटीबॉडी-क्षीण सीरम शामिल था। परिणाम बताते हैं कि प्रतिरक्षित जानवरों के सीरम में मौजूद एंटीबॉडी विट्रो में कैंडिडा बायोफिल्म परिपक्वता को रोक सकते हैं। सारांश में, यह पेपर आक्रामक कैंडिडिआसिस के दौरान बायोफिल्म के खिलाफ नए इम्यूनोथेरेपी और सहक्रियात्मक या सहायक उपचार विकसित करने में एंटीबॉडी की क्षमता के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। इस इन विट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग बायोफिल्म में कैंडिडा प्रजातियों की कोशिकाओं की चयापचय गतिविधि पर संभावित नए एंटिफंगल यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
प्रणालीगत कैंडिडिआसिस नोसोकोमियल संक्रमण का चौथा प्रमुख कारण है, जो दुनिया भर में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़ा हुआ है। विश्व स्तर पर, प्रणालीगत कैंडिडिआसिस लगभग 700,000 व्यक्तियों को प्रभावित करताहै। कैंडिडा प्रजातियां, अर्थात् सी अल्बिकन्स, सी ट्रॉपिकलिस, सी पैराप्सिलोसिस, सी ग्लेब्रैटा और सी ऑरिस, आक्रामक कैंडिडा संक्रमण2 का सबसे आम कारण हैं। कैंडिडा प्रजातियां अवसरवादी रोगजनक हैं जो बायोफिल्म का उत्पादन करती हैं। बायोफिल्म मुख्य रूप से कैंडिडा विषाणु से जुड़े होते हैं, और कैंडिडा बायोफिल्म गठन को प्रेरित करके ऑक्सीडेटिव और आसमाटिक तनाव की स्थिति का सामना कर सकता है। बायोफिल्म्स विषाणु कारकों और सेल दीवार घटकों की अभिव्यक्ति को और संशोधित करते हैं और एक एक्सोपॉलीमेरिक सुरक्षात्मक मैट्रिक्स बनाते हैं, जिससे कैंडिडा को विभिन्न मेजबान nichesके अनुकूल होने में मदद मिलती है। बायोफिल्म मेजबान ऊतकों और चिकित्सा उपकरणों पर खमीर पालन में योगदान करतेहैं। जैसे, बायोफिल्म गठन खमीर के लिए एक लाभ के साथ जुड़ा हुआ है, क्योंकि बायोफिल्म के भीतर खमीर कोशिकाएं मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बच सकतीहैं। बायोफिल्म गठन भी रोगजनक खमीर को एंटिफंगल दवाओं की कार्रवाई से बचाताहै। एम्फोटेरिसिन बी के लिए सी अल्बिकन्स बायोफिल्म की संवेदनशीलता में कमी पियर्स एट अल.7,8 द्वारा प्रदर्शित की गई है। इसके अलावा, बायोफिल्म फ्लुकोनाज़ोल के लिए एंटिफंगल दवा प्रतिरोध का प्रदर्शन करते हैं, जो प्रणालीगत कैंडिडिआसिस 9,10 के प्रभावी प्रबंधन को बाधित करता है।
रोगाणुओं में विभिन्न जैविक और अजैविक सतहों का पालन करने की आंतरिक प्रवृत्ति होती है, जिसके परिणामस्वरूप बायोफिल्म का निर्माण होता है। कैंडिडा अल्बिकन्स, जो एक द्विरूपी कवक है, खमीर और हाइफल रूपों में मौजूद है, और इसके बायोफिल्म गठन को विभिन्न इन विट्रो और विवो मॉडल सिस्टम11 में विशेषता दी गई है। बायोफिल्म गठन के चरणों में कैंडिडा कोशिकाओं का सब्सट्रेट, फिलामेंटेशन, प्रसार और बायोफिल्म परिपक्वता11 में आसंजन शामिल है। अल्बिकन्स का खमीर रूप चिकित्सा उपकरणों और मानव ऊतक सहित सब्सट्रेट्स का पालन करता है, इसके बाद सी अल्बिकन्स का हाइफल और स्यूडोहाइफाल रूपों में फिलामेंटेशन और प्रसार होता है, और अंत में बाह्य मैट्रिक्स11 में एम्बेडेड बायोफिल्म की परिपक्वता होती है। बायोफिल्म गठन काफी हद तक सी अल्बिकन्स रोगजनन तंत्र12 में योगदान देता है। कैंडिडा प्रजातियां दवा प्रतिरोधी बायोफिल्म बनाती हैं, जो उनकेउन्मूलन को चुनौतीपूर्ण बनाती हैं। अल्बिकन्स बायोफिल्म उत्पादक आबादी के एक छोटे से उप-समूह को एंटिफंगल दवाओं एम्फोटेरिसिन बी और क्लोरहेक्सिडीन14 के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी के रूप में वर्णित किया गया है। ध्यान दें, बायोफिल्म में खमीर कोशिकाएं प्लवक चरण और प्रसार चरण14 में खमीर कोशिकाओं की तुलना में मल्टीड्रग थेरेपी के लिए उच्च प्रतिरोध प्रदर्शित करती हैं। यह सुझाव दिया गया है कि बायोफिल्म में मौजूद खमीर कोशिकाएं एंटिफंगल दवाओं के प्रति अत्यधिक सहिष्णु हैं, जो बायोफिल्म14 में सी अल्बिकन्स के अस्तित्व में योगदान देती हैं। इन मौजूदा कोशिकाओं को सी अल्बिकन्स के फेनोटाइपिक वेरिएंट के रूप में रिपोर्ट किया गया था, न कि म्यूटेंट14। इसके अलावा, कैंडिडा बायोफिल्म की कोशिकाएं जिन्हें “परसिस्टर कोशिकाओं” के रूप में जाना जाता है, एम्फोटेरिसिन-बी उपचार की उच्च खुराक के प्रति सहिष्णु हैं और कैंडिडा के अस्तित्व में योगदान करते हैं, जिससे उच्च जोखिम वाले व्यक्तियों में आवर्ती प्रणालीगत कैंडिडा संक्रमण का एक बड़ा बोझ पैदा होताहै।
कैंडिडा उपभेदों में एंटिफंगल दवा प्रतिरोध में वृद्धि नए एंटिफंगल एजेंटों और इम्यूनोथेरेपी के लिए अनुसंधान की आवश्यकता है। जैसा कि उपर्युक्त अध्ययनों से स्पष्ट है, कैंडिडा बायोफिल्म एंटिफंगल दवाओं के लिए संवेदनशीलता में कमी दिखाते हैं। इसलिए, कैंडिडा बायोफिल्म गठन को नियंत्रित करने के लिए बेहतर इम्यूनोथेरेपी की आवश्यकता है। पहले के अध्ययनों से पता चला है कि सीएजीटीए विट्रो16 में सी अल्बिकन्स बायोफिल्म गठन को रोककर प्रणालीगत कैंडिडा संक्रमण के खिलाफ प्रभावी सुरक्षा प्रदान कर सकता है। एक अन्य अध्ययन में बताया गया है कि सी अल्बिकन्स आरएएल3-एन प्रोटीन के साथ चूहों का टीकाकरण उच्च एंटीबॉडी टिटर्स को प्रेरित करता है जो विट्रो17 में सी अल्बिकन्स बायोफिल्म गठन में हस्तक्षेप करते हैं। एंटी-एएलएस 3-एन एंटीबॉडी ने बायोफिल्म17 से सी अल्बिकन्स फैलाव पर एक निरोधात्मक प्रभाव भी डाला। सी अल्बिकन्स पर आधारित एनडीवी -3 ए वैक्सीन वर्तमान में नैदानिक परीक्षण के अधीन है और एंटी-एनडीवी -3 ए सेरा को सी ऑरिस बायोफिल्म गठन18 को कम करने के लिए भी पाया गया था। हाल के एक अध्ययन ने प्रणालीगत कैंडिडिआसिस19 के मुराइन मॉडल में एक सुरक्षा तंत्र के रूप में एसएपी 2-एंटीबॉडी द्वारा बायोफिल्म गठन के निषेध की पहचान की।
यह पेपर पूर्वनिर्मित कैंडिडा ट्रॉपिकलिस बायोफिल्म पर एसएपी 2 टीकाकरण वाले चूहों के विभिन्न समूहों से प्राप्त पॉलीक्लोनल सीरम में मौजूद एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत इन विट्रो प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है। इसे प्राप्त करने के लिए, एक एक्सटीटी कमी परख पर आधारित एक विधि को प्रयोगशाला में अनुकूलित और विकसित किया गया था, जो एंटीबॉडी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में, एक तेज, संवेदनशील और उच्च-थ्रूपुट तरीके से बायोफिल्म व्यवहार्यता को माप सकता है।
एक्सटीटी परख का उपयोग सेल व्यवहार्यता, सेलुलर प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी20 के संकेतक के रूप में सेलुलर चयापचय गतिविधि को मापने के लिए किया जाता है। यह कलरिमेट्रिक परख एक पीले टेट्राज़ोलियम नमक, सोडियम 3′-[1-(फेनिलामिनोकार्बोनिल)-3,4-टेट्राज़ोलियम]-बिस (4-मेथॉक्सी-6-नाइट्रो) बेंजीन सल्फोनिक एसिड हाइड्रेट (एक्सटीटी) को चयापचय रूप से सक्रिय कोशिकाओं द्वारा नारंगी फॉर्माज़ान डाई में कम करने पर आधारित है। चूंकि केवल व्यवहार्य कोशिकाएं एक्सटीटी को कम कर सकती हैं, इसलिए कम एक्सटीटी फॉर्माज़ान की मात्रा रंग और सेल व्यवहार्यता की तीव्रता के आनुपातिक है। गठित फॉर्माज़ान डाई पानी में घुलनशील है और सीधे प्लेट रीडर का उपयोग करके निर्धारित की जाती है। इसकी पानी में घुलनशील प्रकृति के कारण, एक्सटीटी परख बरकरार बायोफिल्म के अध्ययन की अनुमति देता है, साथ ही बायोफिल्म संरचना 21 के व्यवधान के बिना बायोफिल्म दवा संवेदनशीलता की परीक्षा भीदेता है। इसके अतिरिक्त, इस विधि को कैंडिडा फंगल व्यवहार्यता आकलन में इसके उपयोग में आसानी, गति, सटीकता, उच्च थ्रूपुट और प्रजनन क्षमता की उच्च डिग्री 7,22 के कारण लागू किया गया है।
एक्सटीटी कमी परख के अलावा, बायोफिल्म मात्रा के माप के लिए कई वैकल्पिक तकनीकों की भी पहचान की गई है। इनमें से कुछ में एमटीटी रिडक्शन परख, क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग, डीएनए परिमाणीकरण, मात्रात्मक पीसीआर, प्रोटीन परिमाणीकरण, शुष्क सेल वजन माप और व्यवहार्य कॉलोनी गिनती का उपयोग शामिल है। ये प्रक्रियाएं उनके समय और लागत आवश्यकताओं के संदर्भ में व्यापक रूप से भिन्न होती हैं। टैफ एट अल ने सात अलग-अलग कैंडिडा बायोफिल्म की मात्रा का तुलनात्मक विश्लेषण किया और पाया कि एक्सटीटी परख ने सी अल्बिकन्स बायोफिल्म23 के मात्रात्मक अनुमान के लिए सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सटीक और कुशल विधि प्रदान की। क्रिस्टल वायलेट जैसी धुंधला तकनीकों की कुछ सीमाएं हैं; क्रिस्टल वायलेट परीक्षण अप्रत्यक्ष रूप से क्रिस्टल बैंगनी-दाग वाले बायोफिल्म मैट्रिक्स और कोशिकाओं के ऑप्टिकल घनत्व को मापकर बायोफिल्म की मात्रा निर्धारित करता है। यद्यपि क्रिस्टल वायलेट परख बायोफिल्म द्रव्यमान का एक अच्छा उपाय प्रदान करता है, यह बायोफिल्म व्यवहार्यता का माप नहीं देता है क्योंकि यह माइक्रोबियल कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स24 दोनों को दाग देता है। ढाले एट अल ने आगे बताया कि क्रिस्टल वायलेट परख25 की तुलना में एक्सटीटी कमी परख बायोफिल्म उत्पादन का पता लगाने के लिए सबसे संवेदनशील, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सटीक, कुशल और विशिष्ट विधि थी। साहित्य रिपोर्टों से पता चला है कि एक्सटीटी परख सीएफयू गिनती विधि में सीएफयू / एमएल पैरामीटर के साथ अच्छी तरह से संबंधित है। हालांकि, एक्सटीटी परख की तुलना में, सीएफयू विधि श्रम-गहन और धीमी26 है। इसके अलावा, अलग जीवित कोशिकाओं का अंश प्रारंभिक बायोफिल्म आबादी का प्रतिनिधि नहीं हो सकताहै। यद्यपि एक्सटीटी कमी परख व्यवहार्यता को निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध विकल्प लगता है, इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। जबकि एक्सटीटी विधि एक फंगल तनाव से जुड़ी तुलना के लिए उपयोगी है, विभिन्न फंगल उपभेदों और प्रजातियों की तुलना करते समय इसका उपयोग सीमित हो सकता है। विस्तृत मानकीकरण की अनुपस्थिति में इंटरस्ट्रेन तुलना मुश्किल हो सकती है क्योंकि विभिन्न उपभेदविभिन्न क्षमताओं के साथ सब्सट्रेट्स को चयापचय करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंडिडा प्रजातियों के कारण होने वाले फंगल संक्रमण दुनिया भर में उच्च रुग्णता और मृत्यु दर से जुड़े हैं। आक्रामक फंगल संक्रमण के बढ़ते खतरे के लिए ऐसी जानलेवा बीमारियों के शुरुआती प्रबंधन की आवश्य…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को रामलिंगस्वामी अनुदान डीबीटी-843-बायो (जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार) और एस.आर. को प्रारंभिक कैरियर अनुसंधान पुरस्कार एसईआर-1058-बीआईओ (विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड, भारत सरकार) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक ों ने पी.सी. को आईसीएमआर-जेआरएफ अनुदान और पी.एस. को डीबीटी-जेआरएफ अनुदान स्वीकार किया है। लेखक एसईएम के दौरान श्री प्रदीप सिंह ठाकुर द्वारा पांडुलिपि और तकनीकी सहायता पर सुझाव देने के लिए डॉ रविकांत रंजन को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | – | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
| 96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
| Incubator | Generic | ||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate Reader | Generic | ||
| Multichannel pipette and tips | Generic | ||
| Petri dishes | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactate | – | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
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