カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ
Summary
C. tropicalisによって形成されるバイオフィルムに対する抗体の影響を研究するために、2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキシアニリド-2H-テトラゾリウム(XTT)還元アッセイを使用した96ウェルマイクロタイタープレートベースのプロトコルが本明細書に記載されています。このin vitroプロトコルは、バイオフィルム中のカンジダ種細胞の代謝活性に対する潜在的な新しい抗真菌化合物の効果を確認するために使用できます。
Abstract
カンジダ 種は、全身性院内感染の4番目に一般的な原因です。全身性または侵襲性カンジダ症は、埋め込み型デバイスまたはカテーテルでのバイオフィルム形成を伴うことが多く、これは病原性および死亡率の増加と関連している。異なる カンジダ 種によって産生されたバイオフィルムは、様々な抗真菌薬に対する耐性が増強される。したがって、 カンジダ バイオフィルムに対する効果的な免疫療法または補助療法を開発する必要があります。細胞性免疫の役割は抗カンジダ 防御において十分に確立されているが、体液性免疫の役割はあまり研究されていない。
バイオフィルム形成と成熟の阻害は防御抗体の主要な機能の1つであると仮定されており、カンジダ・アルビカンス生殖管抗体(CAGTA)は、C.アルビカンスのin vitro増殖とバイオフィルム形成を早期に抑制することが示されています。この論文は、C. tropicalisによって形成されたバイオフィルム上の抗体の役割を評価するための詳細なプロトコルを概説します。このプロトコルの方法論では、96ウェルマイクロタイタープレートでC. tropicalisバイオフィルムを形成し、抗原特異的抗体の存在下または非存在下でインキュベートした後、バイオフィルム中の真菌細胞の代謝活性を測定するための2,3-ビス(2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル)-5-カルボキシアニリド-2H-テトラゾリウム(XTT)アッセイを行います。
特異性は、Sap2特異的抗体枯渇血清を含む適切な血清コントロールを用いて確認した。結果は、免疫動物の血清中に存在する抗体がin vitroでカンジダバイオフィルム成熟を阻害できることを示しています。要約すると、この論文は、侵襲性カンジダ症中のバイオフィルムに対する新しい免疫療法および相乗的または補助的治療の開発における抗体の可能性に関する重要な洞察を提供します。このin vitroプロトコルは、バイオフィルム中のカンジダ種細胞の代謝活性に対する潜在的な新しい抗真菌化合物の効果を確認するために使用できます。
Introduction
全身性カンジダ症は院内感染の4番目の主要な原因であり、世界中で高い罹患率と死亡率に関連しています。世界的に、全身性カンジダ症は約70万人に影響を及ぼします1。カンジダ種、すなわちC.アルビカンス、C.トロピカリス、C.パラプシロシス、C.グラブラタ、およびC.アウリスは、侵襲性カンジダ感染症の最も一般的な原因です2。 カンジダ種は、バイオフィルム3を産生する日和見病原体です。バイオフィルムは主にカンジダの病原性に関連しており、カンジダはバイオフィルム形成を誘導することにより酸化的および浸透圧ストレス条件に耐えることができます4。バイオフィルムは、病原性因子と細胞壁成分の発現をさらに調節し、高分子外保護マトリックスを形成し、カンジダがさまざまな宿主ニッチに適応するのを助けます4。バイオフィルムは、宿主組織や医療機器への酵母の接着に貢献します5。このように、バイオフィルム内の酵母細胞が宿主の免疫応答を回避できるため、バイオフィルム形成は酵母にとって有利である6。バイオフィルム形成はまた、抗真菌薬の作用から病原性酵母を保護します5。C.アルビカンスバイオフィルムのアムホテリシンBに対する感受性の低下は、Pierceらによって実証されています7,8。さらに、バイオフィルムはフルコナゾールに対する抗真菌薬耐性を示し、全身性カンジダ症の効果的な管理を損ないます9,10。
微生物は、さまざまな生物的および非生物的表面に付着する固有の傾向があり、その結果、バイオフィルムが形成されます。二形性真菌であるカンジダ・アルビカンスは、酵母および菌糸の形で存在し、そのバイオフィルム形成は、さまざまなin vitroおよびin vivoモデルシステムで特徴付けられています11。バイオフィルム形成のステップには、基質へのカンジダ細胞の接着、フィラメント形成、増殖、およびバイオフィルム成熟が含まれる11。最初に、酵母型のC.アルビカンスは、医療機器およびヒト組織を含む基質に接着し、続いてC.アルビカンスの糸状化および菌糸および偽菌糸形態への増殖、そして最後に細胞外マトリックスに埋め込まれたバイオフィルムの成熟が続く11。バイオフィルム形成は、C. albicansの病因メカニズムに大きく寄与しています12。カンジダ種は薬剤耐性バイオフィルムを形成するため、根絶が困難になります13。C.アルビカンスのバイオフィルム産生集団の小さなサブセットは、抗真菌薬アムホテリシンBおよびクロルヘキシジン14に対して非常に耐性があると説明されています。注目すべきことに、バイオフィルム中の酵母細胞は、プランクトン期および増殖期14の酵母細胞と比較して、多剤併用療法に対して高い耐性を示す。バイオフィルム中に存在する酵母細胞は抗真菌薬に対する耐性が高く、バイオフィルム中のC. albicansの生存に寄与していることが示唆されています14。これらの既存の細胞は、変異体ではなくC.アルビカンスの表現型変異体であると報告された14。さらに、「持続性細胞」として知られるカンジダバイオフィルムの細胞は、高用量のアムホテリシンB治療に耐性があり、カンジダの生存に寄与するため、高リスクの個人に再発する全身性カンジダ感染の大きな負担をもたらします15。
カンジダ株における抗真菌薬耐性の増加は、新しい抗真菌剤および免疫療法の研究を必要とする。上記の研究から明らかなように、カンジダバイオフィルムは抗真菌薬に対する感受性の低下を示しています。したがって、カンジダバイオフィルム形成を制御するための改善された免疫療法が必要である。以前の研究では、CAGTAがin vitroでC.アルビカンスのバイオフィルム形成を阻害することにより、全身性カンジダ感染症に対する効果的な保護を提供できることが示されています16。別の研究では、マウスにC.アルビカンスrAls3-Nタンパク質を免疫すると、インビトロでのC.アルビカンスのバイオフィルム形成を妨げる高い抗体価が誘導されることが報告されています17。 抗Als3-N抗体は、バイオフィルムからのC.アルビカンス分散に対しても阻害効果を発揮した17。C.アルビカンスに基づくNDV-3Aワクチンは現在臨床試験中であり、抗NDV-3A血清もC.オーリスバイオフィルム形成を減少させることが見出された18。最近の研究では、全身性カンジダ症のマウスモデルにおける保護メカニズムとして、Sap2抗体によるバイオフィルム形成の阻害が特定されました19。
この論文は、Sap2ワクチン接種マウスのさまざまなグループから得られたポリクローナル血清に存在する抗原特異的抗体が、事前に形成されたカンジダトロピカリスバイオフィルムに及ぼす影響を評価するための詳細なin vitroプロトコルの概要を示しています。これを達成するために、XTT還元アッセイに基づく方法が実験室で最適化および開発され、抗体の有無にかかわらず、バイオフィルムの生存率を高速、高感度、およびハイスループットの方法で測定できます。
XTTアッセイは、細胞生存率、細胞増殖、および細胞毒性の指標として細胞代謝活性を測定するために使用されます20。この比色アッセイは、代謝活性細胞による黄色テトラゾリウム塩ナトリウム3′-[1-(フェニルアミノカルボニル)-3,4-テトラゾリウム]-ビス(4-メトキシ-6-ニトロ)ベンゼンスルホン酸水和物(XTT)のオレンジホルマザン色素への還元に基づいています。生存細胞のみがXTTを減少させることができるので、減少したXTTホルマザンの量は、色の強度および細胞生存率に比例する。形成されたホルマザン色素は水溶性であり、プレートリーダーを使用して直接定量されます。その水溶性の性質により、XTTアッセイは、バイオフィルム構造を破壊することなく、無傷のバイオフィルムの研究、ならびにバイオフィルムの薬物感受性の検査を可能にする21。さらに、この方法は、その使いやすさ、速度、精度、高スループット、および高い再現性のために、カンジダ菌の生存率評価に実装されています7,22。
XTT還元アッセイに加えて、バイオフィルム量の測定のための多数の代替技術も同定されている。これらのいくつかには、MTT還元アッセイ、クリスタルバイオレット染色、DNA定量、定量PCR、タンパク質定量、乾燥細胞重量測定、および生菌コロニーカウントの使用が含まれます。これらの手順は、時間とコストの要件の点で大きく異なります。Taffらは、7つの異なるカン ジダ バイオフィルム定量アッセイの比較分析を実施し、XTTアッセイが C.アルビカンス バイオフィルムの定量的推定のための最も再現性があり、正確で、効率的な方法を提供することを発見しました23。クリスタルバイオレットなどの染色技術には特定の制限があります。クリスタルバイオレット試験は、クリスタルバイオレット染色されたバイオフィルムマトリックスと細胞の光学密度を測定することにより、バイオフィルムの量を間接的に決定します。クリスタルバイオレットアッセイはバイオフィルム質量の良好な尺度を提供するが、微生物細胞および細胞外マトリックス24の両方を染色するので、バイオフィルム生存率の尺度を与えない。Dhaleらはさらに、XTT還元アッセイは、クリスタルバイオレットアッセイと比較して、バイオフィルム産生を検出するための最も感度が高く、再現性があり、正確で、効率的で、特異的な方法であると報告しました25。文献報告によると、XTTアッセイはCFU計数法のCFU/mLパラメータとよく相関しています。ただし、XTTアッセイと比較して、CFU法は労働集約的で遅い26。さらに、分離された生細胞の画分は、初期のバイオフィルム集団27を代表するものではないかもしれない。XTT還元アッセイは、生存率を定量化するための最良の選択肢のようですが、この手法にはいくつかの制限があります。XTT法は、1つの真菌株を含む比較には有用ですが、異なる真菌株および種を比較する場合、その使用が制限される可能性があります。異なる株が異なる能力を持つ基質を代謝するため、詳細な標準化がない場合、菌株間比較は困難な場合があります21。
Protocol
Representative Results
Discussion
カンジダ種によって引き起こされる真菌感染症は、世界中で高い罹患率と死亡率に関連しています。侵襲性真菌感染症の脅威の高まりは、そのような生命を脅かす病気の早期管理を必要とします。ほとんどのカンジダ感染症は、さまざまな医療機器に付着し、病院環境での真菌感染症の持続と再発の原因となるバイオフィルムの形成を伴います31。バイオフィ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ラマリンガスワミ助成金DBT-843-BIO(インド政府バイオテクノロジー省)および早期キャリア研究賞SER-1058-BIO(インド政府科学技術研究委員会)によってS.R.に支援されました。著者らは、ICMR-JRFのP.C.への助成金とDBT-JRFのP.S.への助成金を認めている。著者らは、SEM中のPradeep Singh Thakur氏による原稿と技術支援に関する提案について、Ravikant Ranjan博士に感謝する。
Materials
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | – | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
| 96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
| Incubator | Generic | ||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate Reader | Generic | ||
| Multichannel pipette and tips | Generic | ||
| Petri dishes | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactate | – | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
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