칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 가용성 테트라졸륨 기반 환원 분석
Summary
C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하기 위해 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 환원 분석을 사용하는 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 프로토콜이 본원에 설명되어 있습니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
칸디다 종은 전신 병원 감염의 네 번째로 흔한 원인입니다. 전신 또는 침습성 칸디다증은 종종 이식 된 장치 또는 카테터에 생물막 형성을 수반하며, 이는 독성 및 사망률 증가와 관련이 있습니다. 다른 칸디다 종에 의해 생성 된 생물막은 다양한 항진균제에 대해 향상된 내성을 나타냅니다. 따라서, 칸디다 생물막에 대한 효과적인 면역요법 또는 보조 치료법을 개발할 필요가 있다. 세포 면역의 역할은 항 칸디다 보호에서 잘 확립되어 있지만 체액 면역의 역할은 덜 연구되었습니다.
생물막 형성 및 성숙의 억제는 보호 항체의 주요 기능 중 하나이며, 칸디다 알비칸스 생식관 항체(CAGTA)는 C. 알비칸스의 시험관 내 성장 및 생물막 형성을 조기에 억제하는 것으로 나타났습니다. 이 논문은 C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 역할을 평가하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 방법론은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 C. tropicalis 생물막을 형성한 다음 항원 특이적 항체의 존재 또는 부재 하에서 배양한 다음 생물막에서 진균 세포의 대사 활성을 측정하기 위한 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 분석을 포함합니다.
특이성은 Sap2-특이적 항체-고갈된 혈청을 포함하는 적절한 혈청 대조군을 사용하여 확인하였다. 상기 결과는 면역화된 동물의 혈청에 존재하는 항체가 시험관내에서 칸디다 생물막 성숙을 억제할 수 있음을 입증한다. 요약하면, 이 논문은 침습성 칸디다증 동안 생물막에 대한 새로운 면역 요법 및 시너지 또는 보조 치료법을 개발하는 데 있어 항체의 잠재력에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
전신 칸디다증은 전 세계적으로 높은 이환율 및 사망률과 관련된 병원 감염의 네 번째 주요 원인입니다. 전 세계적으로 전신성 칸디다증은 약 700,000명의 개인에게 영향을 미칩니다1. 칸디다 종, 즉 C. 알비칸스, C. 트로피칼리스, C. 파라프실라증, C. 글라브라타, 및 C. 아우리스는 침습성 칸디다 감염의 가장 흔한 원인입니다2. 칸디다 종은 생물막을 생성하는 기회 주의적 병원체입니다3. 생물막은 주로 칸디다 균병과 관련이 있으며, 칸디다 균은 생물막 형성을 유도하여 산화 및 삼투압 스트레스 조건을 견딜 수 있습니다4. 생물막은 독성 인자 및 세포벽 성분의 발현을 추가로 조절하고 외중합체 보호 매트릭스를 형성하여 칸디다가 다른 숙주 틈새에 적응하도록 돕습니다4. 생물막은 숙주 조직 및 의료 기구에 대한 효모 부착에 기여합니다5. 이와 같이, 생물막 형성은 효모에 대한 이점과 연관되는데, 이는 생물막 내의 효모 세포가 숙주면역 반응을 회피할 수 있기 때문이다6. 생물막 형성은 또한 항진균제의 작용으로부터 병원성 효모를 보호합니다5. 암포테리신 B에 대한 C. 알비칸스 생물막의 감수성 감소는 Pierce et al.7,8에 의해 입증되었습니다. 또한, 생물막은 플루코나졸에 대한 항진균성 약물 내성을 입증하여 전신 칸디다증의 효과적인 관리를 손상시킵니다 9,10.
미생물은 다양한 생물 및 비 생물 적 표면에 부착하는 본질적인 경향을 가지고있어 생물막 형성을 초래합니다. 이형 곰팡이 인 칸 디다 알비 칸스 (Candida albicans)는 효모 및 균사 형태로 존재하며, 그의 생물막 형성은 다양한 시험관 내 및 생체 내 모델 시스템11에서 특성화되었다. 생물막 형성의 단계는 기질에 대한 칸디다 세포의 부착, 필라멘트화, 증식, 및 생물막 성숙(11)을 포함한다. 처음에는 효모 형태의 C. albicans가 의료 기기 및 인체 조직을 포함한 기질에 부착 된 다음 C. albicans의 필라멘트 화 및 균사 형태로 증식하고 마지막으로 세포 외 기질11에 내장 된 생물막이 성숙합니다. 생물막 형성은 C. albicans의 발병 기전 메커니즘에 크게 기여합니다12. 칸디다 종은 약물 내성 생물막을 형성하여 박멸을 어렵게 만듭니다13. C. albicans 생물막 생성 집단의 작은 하위 집합은 항진균제 암포테리신 B 및 클로르헥시딘14에 대해 매우 내성이 있는 것으로 설명되었습니다. 참고로, 생물막의 효모 세포는 플랑크톤 단계 및 증식 단계14의 효모 세포에 비해 다제 요법에 대해 높은 내성을 나타냅니다. 생물막에 존재하는 효모 세포는 항진균제에 대해 매우 내성이 있으며, 이는 생물막에서 C. albicans의 생존에 기여한다고 제안되었습니다14. 이들 기존 세포는 돌연변이14가 아닌 C. albicans의 표현형 변이체인 것으로 보고되었다. 더욱이, “지속성 세포”로 알려진 칸디다 생물막의 세포는 고용량의 암포테리신-B 치료에 내성이 있고 칸디다 생존에 기여하여 고위험 개인에서 재발하는 전신 칸디다 감염의 큰 부담을 초래합니다15.
칸디다 균주에서 항진균제 내성이 증가함에 따라 새로운 항진균제 및 면역 요법에 대한 연구가 필요합니다. 위에서 언급 한 연구에서 분명히 알 수 있듯이 칸디다 생물막은 항진균제에 대한 감수성이 감소한 것으로 나타났습니다. 따라서, 칸디다 생물막 형성을 조절하기 위한 개선된 면역요법이 필요하다. 이전 연구에 따르면 CAGTA는 시험관 내16에서 C. albicans의 생물막 형성을 억제함으로써 전신 칸디다 감염에 대한 효과적인 보호를 제공 할 수 있습니다. 또 다른 연구에서는 C. albicans rAls3-N 단백질로 마우스를 면역화하면 시험관 내17에서 C. albicans 생물막 형성을 방해하는 높은 항체가를 유도한다고 보고했습니다. 항-Als3-N 항체는 또한 생물막으로부터 C. 알비칸스 분산에 억제 효과를 발휘하였다17. C. albicans를 기반으로 한 NDV-3A 백신은 현재 임상 시험 중이며 항 -NDV-3A 혈청도 C. auris 생물막 형성18을 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 최근 연구에서는 전신 칸디다증의 쥐 모델에서 보호 메커니즘으로 Sap2- 항체에 의한 생물막 형성 억제를 확인했습니다19.
이 논문은 미리 형성된 칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 다양한 그룹의 Sap2 백신 접종 마우스에서 얻은 다클론 혈청에 존재하는 항원 특이적 항체의 효과를 평가하기 위한 자세한 시험관 내 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이를 달성하기 위해 XTT 환원 분석을 기반으로 하는 방법이 실험실에서 최적화 및 개발되었으며, 이는 항체의 유무에 관계없이 빠르고 민감하며 처리량이 높은 방식으로 생물막 생존율을 측정할 수 있습니다.
XTT 분석은 세포 생존력, 세포 증식 및 세포 독성20의 지표로서 세포 대사 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 이 비색 분석은 황색 테트라졸륨 염, 나트륨 3′-[1-(페닐아미노카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠술폰산 수화물(XTT)을 대사 활성 세포에 의한 주황색 포르마잔 염료로 환원시키는 것을 기반으로 합니다. 생존 가능한 세포 만이 XTT를 감소시킬 수 있기 때문에, 감소 된 XTT 포르 마잔의 양은 색의 강도 및 세포 생존력에 비례한다. 형성된 포르마잔 염료는 수용성이며 플레이트 리더를 사용하여 직접 정량됩니다. 수용성 특성으로 인해 XTT 분석은 생물막 구조를 방해하지 않고 손상되지 않은 생물막을 연구하고 생물막 약물 감수성을 검사할 수 있습니다(21). 또한이 방법은 사용 용이성, 속도, 정확성, 높은 처리량 및 높은 재현성 7,22로 인해 칸디다 곰팡이 생존력 평가에서 구현됩니다.
XTT 감소 분석 외에도 생물막 양 측정을 위한 수많은 대체 기술이 확인되었습니다. 이들 중 일부에는 MTT 환원 분석, 크리스탈 바이올렛 염색, DNA 정량화, 정량적 PCR, 단백질 정량화, 건조 세포 중량 측정 및 생존 가능한 콜로니 계수의 사용이 포함됩니다. 이러한 절차는 시간 및 비용 요구 사항 측면에서 매우 다양합니다. Taff 등은 7개의 서로 다른 칸디다 생물막 정량 분석의 비교 분석을 수행했으며 XTT 분석이 C. albicans의 생물막23의 정량적 추정을 위한 가장 재현 가능하고 정확하며 효율적인 방법을 제공한다는 것을 발견했습니다. 크리스탈 바이올렛과 같은 염색 기술에는 특정 제한이 있습니다. 크리스탈 바이올렛 테스트는 크리스탈 바이올렛 염색 생물막 매트릭스 및 세포의 광학 밀도를 측정하여 간접적으로 생물막의 양을 결정합니다. 크리스탈 바이올렛 분석은 생물막 질량의 양호한 측정을 제공하지만, 미생물 세포 및 세포외 매트릭스(24) 모두를 염색하기 때문에 생물막 생존율의 척도를 제공하지 않는다. Dhale 등은 XTT 환원 분석이 크리스탈 바이올렛 분석25와 비교하여 생물막 생성을 검출하는 가장 민감하고 재현 가능하며 정확하고 효율적이며 구체적인 방법이라고 추가로 보고했습니다. 문헌 보고서에 따르면 XTT 분석은 CFU 계수 방법의 CFU/mL 매개변수와 잘 연관되어 있습니다. 그러나 XTT 분석에 비해 CFU 방법은 노동 집약적이며 느립니다26. 더욱이, 분리된 살아있는 세포의 분획은 초기 생물막 집단(27)을 대표하지 않을 수 있다. XTT 감소 분석이 생존력을 정량화하는 데 가장 적합한 옵션으로 보이지만 이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. XTT 방법은 하나의 곰팡이 균주와 관련된 비교에 유용하지만 다른 곰팡이 균주 및 종을 비교할 때 사용이 제한될 수 있습니다. 균주 간 비교는 상세한 표준화가 없을 때 어려울 수 있는데, 이는 상이한 균주가 상이한 능력21을 갖는 기질을 대사하기 때문이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
칸디다 종에 의한 곰팡이 감염은 전 세계적으로 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 침습성 곰팡이 감염의 위협이 증가함에 따라 생명을 위협하는 질병의 조기 관리가 필요합니다. 대부분의 칸디다 감염은 다양한 의료 기기에 부착되고 병원 환경에서 곰팡이 감염의 지속과 재발을 담당하는 생물막의 형성을 포함합니다31. 생물막은 효모 또는 균사 세포로 구…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 Ramalingaswami 보조금 DBT-843-BIO (인도 정부 생명 공학부) 및 조기 경력 연구 상 SER-1058-BIO (인도 정부 과학 및 공학 연구위원회)의 지원을 받았습니다. 저자는 PC에 대한 ICMR-JRF 보조금과 PS에 대한 DBT-JRF 보조금을 인정합니다. 저자는 SEM 기간 동안 Pradeep Singh Thakur 씨의 원고 및 기술 지원에 대한 제안에 대해 Ravikant Ranjan 박사에게 감사드립니다.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | – | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
| 96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
| Incubator | Generic | ||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate Reader | Generic | ||
| Multichannel pipette and tips | Generic | ||
| Petri dishes | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactate | – | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
- Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
- Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
- Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
- Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
- Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
- Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
- Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
- Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
- Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
- Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
- Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
- Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
- Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
- Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
- Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , 95-105 (2016).
- Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
- Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
- Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
- Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
- Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
- Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
- Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
- Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
- Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
- Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
- Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
- Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
- Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
- Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).
