Растворимый редукционный анализ на основе тетразолия для оценки влияния антител на биопленки Candida tropicalis

Summary

В настоящем документе описан протокол на основе пластин на основе 96-луночных микротитров с использованием редукционного анализа 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилида-2H-тетразолия (XTT) для изучения влияния антител на биопленки, образованные C. tropicalis. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.

Abstract

Виды Candida являются четвертой наиболее распространенной причиной системных внутрибольничных инфекций. Системный или инвазивный кандидоз часто включает образование биопленки на имплантированных устройствах или катетерах, что связано с повышенной вирулентностью и смертностью. Биопленки, производимые различными видами Candida , проявляют повышенную устойчивость к различным противогрибковым препаратам. Поэтому существует необходимость в разработке эффективных иммунотерапий или дополнительных методов лечения против биопленок Candida . В то время как роль клеточного иммунитета хорошо известна в антикандидозной защите, роль гуморального иммунитета изучена меньше.

Было выдвинуто предположение, что ингибирование образования и созревания биопленки является одной из основных функций защитных антител, а антитела зародышевой трубки Candida albicans (CAGTA), как было показано, подавляют рост in vitro и образование биопленки C. albicans ранее. В этой статье излагается подробный протокол оценки роли антител на биопленках, образованных C. tropicalis. Методология для этого протокола включает образование биопленки C. tropicalis в 96-луночных микротитрных пластинах, которые затем инкубировали в присутствии или отсутствии антиген-специфических антител с последующим анализом 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилид-2H-тетразолий (XTT) для измерения метаболической активности грибковых клеток в биопленке.

Специфичность была подтверждена с использованием соответствующих сывороточных контролей, включая Sap2-специфическую сыворотку, обедненную антителами. Результаты показывают, что антитела, присутствующие в сыворотке иммунизированных животных, могут ингибировать созревание биопленки Candida in vitro. Таким образом, эта статья дает важную информацию о потенциале антител в разработке новых иммунотерапий и синергетических или дополнительных методов лечения против биопленок во время инвазивного кандидоза. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.

Introduction

Системный кандидоз является четвертой основной причиной внутрибольничных инфекций, которые связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности во всем мире. В глобальном масштабе системный кандидоз поражает примерно 700 000 человек¹. Виды Candida, а именно C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata и C. auris, являются наиболее распространенной причиной инвазивных инфекций Candida ². Виды Candida являются условно-патогенными микроорганизмами, которые производят биопленки³. Биопленки преимущественно связаны с вирулентностью Candida, и Candida может противостоять окислительным и осмотическим стрессовым условиям, индуцируя образование биопленки⁴. Биопленки дополнительно модулируют экспрессию факторов вирулентности и компонентов клеточной стенки и образуют экзополимерную защитную матрицу, помогая Candida адаптироваться к различным нишам хозяина ⁴. Биопленки способствуют адгезии дрожжей на тканях хозяина и медицинских инструментах⁵. Таким образом, образование биопленки связано с преимуществом дрожжей, поскольку дрожжевые клетки в биопленках могут уклоняться от иммунного ответа хозяина⁶. Образование биопленки также защищает патогенные дрожжи от действия противогрибковых препаратов⁵. Снижение восприимчивости биопленок C. albicans к амфотерицину B было продемонстрировано Pierce et ^al.7,8. Кроме того, биопленки демонстрируют устойчивость к флуконазолу к противогрибковым препаратам, что ухудшает эффективное ведение системного кандидоза ^9,10.

Микробы имеют внутреннюю тенденцию прилипать к различным биотическим и абиотическим поверхностям, что приводит к образованию биопленки. Candida albicans, которая является диморфным грибом, существует в дрожжевой и гифальной формах, и ее образование биопленки было охарактеризовано в различных модельных системах in vitro и in vivo ¹¹. Этапы образования биопленки включают адгезию клеток Candida к субстрату, нить, пролиферацию и созревание биопленки¹¹. Первоначально дрожжевая форма C. albicans прилипает к субстратам, включая медицинские устройства и ткани человека, за которыми следует нить и пролиферация C. albicans в гифальные и псевдогифальные формы и, наконец, созревание биопленок, встроенных во внеклеточный матрикс¹¹. Образованию биопленки в значительной степени способствует механизмы патогенеза C. albicans ¹². Виды Candida образуют устойчивые к лекарствам биопленки, что затрудняет их искоренение¹³. Небольшое подмножество популяции, продуцирующей биопленку C. albicans , было описано как обладающее высокой устойчивостью к противогрибковым препаратам амфотерицину B и хлоргексидину¹⁴. Следует отметить, что дрожжевые клетки в биопленках демонстрируют высокую устойчивость к мультилекарственной терапии по сравнению с дрожжевыми клетками в планктонной фазе и фазе пролиферации¹⁴. Было высказано предположение, что дрожжевые клетки, существующие в биопленках, обладают высокой толерантностью к противогрибковым препаратам, что способствует выживанию C. albicans в биопленках¹⁴. Сообщалось, что эти существующие клетки являются фенотипическими вариантами C. albicans , а не мутантами¹⁴. Кроме того, клетки биопленок Candida , известных как «персистентные клетки», устойчивы к высоким дозам лечения амфотерицином-B и способствуют выживанию Candida , тем самым создавая большое бремя повторяющихся системных инфекций Candida у лиц с высоким риском¹⁵.

Увеличение устойчивости к противогрибковым препаратам у штаммов Candida обусловливает необходимость проведения исследований новых противогрибковых средств и иммунотерапии. Как видно из вышеупомянутых исследований, биопленки Candida показывают снижение восприимчивости к противогрибковым препаратам. Поэтому существует необходимость в улучшенной иммунотерапии для контроля образования биопленки Candida . Более ранние исследования показали, что CAGTA может обеспечить эффективную защиту от системных инфекций Candida путем ингибирования образования биопленки C. albicans in vitro¹⁶. В другом исследовании сообщалось, что иммунизация мышей белком C. albicans rAls3-N индуцирует высокие титры антител, которые мешают образованию биопленки C. albicans in vitro¹⁷. Анти-Als3-N антитела также оказывали ингибирующее действие на рассеивание C. albicans из биопленок¹⁷. Вакцина NDV-3A на основе C. albicans в настоящее время находится в стадии клинических испытаний, и было также обнаружено, что сыворотки против NDV-3A уменьшают образование биопленки C. auris ¹⁸. Недавнее исследование выявило ингибирование образования биопленки Sap2-антителами в качестве защитного механизма в мышиной модели системного кандидоза¹⁹.

В данной работе изложен подробный протокол in vitro для оценки влияния антиген-специфических антител, присутствующих в поликлональной сыворотке, полученной от различных групп вакцинированных Мышей Sap2, на предварительно сформированные биопленки Candida tropicalis . Для достижения этой цели был оптимизирован и разработан в лаборатории метод, основанный на анализе восстановления XTT, который может измерять жизнеспособность биопленки быстрым, чувствительным и высокопроизводительным способом, в присутствии или отсутствии антител.

Анализ XTT используется для измерения клеточной метаболической активности в качестве индикатора жизнеспособности клеток, клеточной пролиферации и цитотоксичности²⁰. Этот колориметрический анализ основан на восстановлении желтой тетразолиевой соли, натрия 3′-[1-(фениламинокарбонил)-3,4-тетразолий]-бис (4-метокси-6-нитро)гидрата бензолсульфоновой кислоты (XTT) до оранжевого формазанного красителя метаболически активными клетками. Поскольку только жизнеспособные клетки могут уменьшить XTT, количество восстановленного XTT формазана пропорционально интенсивности цвета и жизнеспособности клеток. Образующийся краситель формазана является водорастворимым и непосредственно количественно определяется с помощью пластинчатого считывателя. Благодаря своей водорастворимой природе, анализ XTT позволяет изучать интактные биопленки, а также исследовать восприимчивость биопленки к лекарственным средствам без нарушения структуры биопленки²¹. Кроме того, этот метод реализован в оценках грибковой жизнеспособности Candida из-за его простоты использования, скорости, точности, высокой пропускной способности и высокой степени воспроизводимости ^7,22.

В дополнение к анализу восстановления XTT были также определены многочисленные альтернативные методы измерения количества биопленки. Некоторые из них включают использование анализа восстановления MTT, окрашивание кристаллической фиалкой, количественную оценку ДНК, количественную ПЦР, количественную оценку белка, измерение веса сухих клеток и подсчет жизнеспособных колоний. Эти процедуры сильно различаются с точки зрения их требований к времени и стоимости. Taff et al. провели сравнительный анализ семи различных количественных анализов биопленки Candida и обнаружили, что анализ XTT обеспечивает наиболее воспроизводимый, точный и эффективный метод количественной оценки биопленок C. albicans ²³. Методы окрашивания, такие как кристаллический фиолетовый, имеют определенные ограничения; кристаллический фиолетовый тест косвенно определяет количество биопленки путем измерения оптической плотности кристаллической фиолетовой матрицы биопленки и клеток. Хотя анализ кристаллической фиалки обеспечивает хорошую меру массы биопленки, он не дает измерения жизнеспособности биопленки, поскольку он окрашивает как микробные клетки, так и внеклеточный матрикс²⁴. Dhale et al. далее сообщили, что анализ восстановления XTT был наиболее чувствительным, воспроизводимым, точным, эффективным и специфическим методом обнаружения производства биопленки по сравнению с анализом кристаллической фиалки²⁵. Литературные отчеты показали, что анализ XTT хорошо коррелирует с параметром CFU/mL в методе подсчета КОЕ. Однако, по сравнению с анализом XTT, метод КОЕ является трудоемким и медленным²⁶. Кроме того, фракция отделившихся живых клеток может не быть репрезентативной для исходной популяции биопленки²⁷. Хотя анализ восстановления XTT кажется лучшим доступным вариантом для количественной оценки жизнеспособности, есть несколько ограничений этого метода. Хотя метод XTT полезен для сравнения с участием одного грибкового штамма, его использование может быть ограничено при сравнении различных грибковых штаммов и видов. Промежуточные сравнения могут быть затруднены в отсутствие детальной стандартизации, поскольку различные штаммы метаболизируют субстраты с различными возможностями²¹.

Protocol

Мыши BALB/c были размещены в Центре мелких животных в IIT Roorkee. Все животные содержались в цикле 12 ч: 12 ч света: темноты при 25 ° C и были обеспечены гранулированной диетой и водой ad libitum. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по этике животных (IAEC) IIT Roorkee. <p cl…

Representative Results

Биопленки Candida tropicalis выращивали в 96-луночных микротитрных пластинах и визуализировали в 40 раз с помощью инвертированного микроскопа (рисунок 1А). Биопленку дополнительно окрашивали с использованием кристаллического фиолетового цвета и наблюдали в 40 раз с помощью ?…

Discussion

Грибковые инфекции, вызванные видами Candida, связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности во всем мире. Растущая угроза инвазивной грибковой инфекции требует раннего лечения таких опасных для жизни заболеваний. Большинство инфекций Candida включают образование би?…

Materials

15 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546021
1x PBS	–	Prepared in lab	NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4:  0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes	BD Falcon	546041
96-well microtiter plates	Nunc	442404
Incubator	Generic
Menadione	Sigma	M5625
Microtiter Plate Reader	Generic
Multichannel pipette and tips	Generic
Petri dishes	Tarson	460090
Ringers Lactate	–	Prepared in lab	sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dextrose Agar	SRL	24613
Sabouraud dextrose Broth	SRL	24835
XTT	Invitrogen	X6493