Un ensayo de reducción soluble a base de tetrazolio para evaluar el efecto de los anticuerpos en las biopelículas de Candida tropicalis
Summary
En el presente documento se describe un protocolo basado en placas de microtitulación de 96 pocillos que utiliza un ensayo de reducción de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT), para estudiar los efectos de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas.
Abstract
Las especies de Candida son la cuarta causa más común de infecciones nosocomiales sistémicas. La candidiasis sistémica o invasiva con frecuencia implica la formación de biopelículas en dispositivos implantados o catéteres, lo que se asocia con un aumento de la virulencia y la mortalidad. Las biopelículas producidas por diferentes especies de Candida exhiben una mayor resistencia contra varios medicamentos antifúngicos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar inmunoterapias efectivas o tratamientos adyuvantes contra las biopelículas de Candida . Si bien el papel de la inmunidad celular está bien establecido en la protección contra Candida , el papel de la inmunidad humoral se ha estudiado menos.
Se ha planteado la hipótesis de que la inhibición de la formación y maduración de biopelículas es una de las principales funciones de los anticuerpos protectores, y se ha demostrado que los anticuerpos del tubo germinal de Candida albicans (CAGTA) suprimen el crecimiento in vitro y la formación de biopelículas de C. albicans antes. Este documento describe un protocolo detallado para evaluar el papel de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. La metodología para este protocolo implica la formación de biopelículas de C. tropicalis en placas de microtitulación de 96 pocillos, que luego se incubaron en presencia o ausencia de anticuerpos específicos de antígeno, seguido de un ensayo de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT) para medir la actividad metabólica de las células fúngicas en la biopelícula.
La especificidad se confirmó mediante el uso de controles séricos apropiados, incluido el suero con depleción de anticuerpos específicos de Sap2. Los resultados demuestran que los anticuerpos presentes en el suero de animales inmunizados pueden inhibir la maduración del biofilm de Candida in vitro. En resumen, este documento proporciona información importante sobre el potencial de los anticuerpos en el desarrollo de nuevas inmunoterapias y tratamientos sinérgicos o adyuvantes contra las biopelículas durante la candidiasis invasiva. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas.
Introduction
La candidiasis sistémica es la cuarta causa principal de infecciones nosocomiales, que se asocian con altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. A nivel mundial, la candidiasis sistémica afecta a aproximadamente 700.000 individuos1. Las especies de Candida, a saber, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata y C. auris, son la causa más común de infecciones invasivas por Candida 2. Las especies de Candida son patógenos oportunistas que producen biopelículas3. Las biopelículas se asocian predominantemente con la virulencia de Candida, y Candida puede soportar condiciones de estrés oxidativo y osmótico al inducir la formación de biopelículas4. Los biofilms modulan aún más la expresión de factores de virulencia y componentes de la pared celular y forman una matriz protectora exopolimérica, ayudando a Candida a adaptarse a diferentes nichos de huésped4. Las biopelículas contribuyen a la adherencia de la levadura en los tejidos del huésped y los instrumentos médicos5. Como tal, la formación de biopelículas se asocia con una ventaja para las levaduras, ya que las células de levadura dentro de las biopelículas pueden evadir la respuesta inmune del huésped6. La formación de biopelículas también protege a las levaduras patógenas de la acción de los fármacos antifúngicos5. La disminución de la susceptibilidad de los biofilms de C. albicans a la anfotericina B ha sido demostrada por Pierce et al.7,8. Además, los biofilms demuestran resistencia a los fármacos antifúngicos al fluconazol, lo que perjudica el manejo eficaz de la candidiasis sistémica 9,10.
Los microbios tienen una tendencia intrínseca a adherirse a diversas superficies bióticas y abióticas, lo que resulta en la formación de biopelículas. Candida albicans, que es un hongo dimórfico, existe en formas de levadura e hifales, y su formación de biofilm ha sido caracterizada en varios sistemas modelo in vitro e in vivo 11. Los pasos de la formación del biofilm incluyen la adhesión de las células de Candida al sustrato, la filamentación, la proliferación y la maduración del biofilm11. Inicialmente, la forma de levadura de C. albicans se adhiere a sustratos, incluidos dispositivos médicos y tejido humano, seguida de filamentación y proliferación de C. albicans en formas hifales y pseudohifales, y finalmente la maduración de biopelículas incrustadas en la matriz extracelular11. La formación de biopelículas contribuye en gran medida a los mecanismos de patogénesis de C. albicans 12. Las especies de Candida forman biopelículas resistentes a los medicamentos, lo que hace que su erradicación sea un desafío13. Un pequeño subconjunto de la población productora de biopelícula de C. albicans ha sido descrito como altamente resistente a los fármacos antifúngicos anfotericina B y clorhexidina14. Cabe destacar que las células de levadura en biopelículas exhiben una alta resistencia a la terapia multifármaco en comparación con las células de levadura en la fase planctónica y la fasede proliferación 14. Se ha sugerido que las células de levadura existentes en las biopelículas son altamente tolerantes a los fármacos antifúngicos, lo que contribuye a la supervivencia de C. albicans en biopelículas14. Estas células existentes fueron reportadas como variantes fenotípicas de C. albicans y no mutantes14. Además, las células de biofilms de Candida conocidas como “células persistentes” son tolerantes a altas dosis de tratamiento con anfotericina-B y contribuyen a la supervivencia de Candida, lo que representa una gran carga de infecciones sistémicas recurrentes por Candida en individuos de alto riesgo15.
El aumento de la resistencia a los medicamentos antifúngicos en las cepas de Candida requiere la investigación de nuevos agentes antifúngicos e inmunoterapias. Como se desprende de los estudios mencionados anteriormente, las biopelículas de Candida muestran una menor susceptibilidad a los medicamentos antimicóticos. Por lo tanto, existe la necesidad de inmunoterapias mejoradas para controlar la formación de biopelículas de Candida. Estudios anteriores han demostrado que CAGTA puede proporcionar una protección eficaz contra las infecciones sistémicas por Candida mediante la inhibición de la formación de biopelículas de C. albicans in vitro16. Otro estudio informó que la inmunización de ratones con la proteína C. albicans rAls3-N induce altos títulos de anticuerpos que interfieren con la formación de biopelículas de C. albicans in vitro17. Los anticuerpos anti-Als3-N también ejercieron un efecto inhibitorio sobre la dispersión de C. albicans de biofilms17. La vacuna NDV-3A basada en C. albicans se encuentra actualmente en ensayo clínico y también se encontró que los sueros anti-NDV-3A reducen la formación de biopelículas de C. auris 18. Un estudio reciente identificó la inhibición de la formación de biopelículas por anticuerpos Sap2 como un mecanismo de protección en un modelo murino de candidiasis sistémica19.
Este documento describe un protocolo in vitro detallado para evaluar el efecto de los anticuerpos antígeno-específicos presentes en el suero policlonal obtenido de diferentes grupos de ratones vacunados con Sap2 en biopelículas preformadas de Candida tropicalis . Para lograr esto, se optimizó y desarrolló en el laboratorio un método basado en un ensayo de reducción XTT, que puede medir la viabilidad del biofilm de manera rápida, sensible y de alto rendimiento, en presencia o ausencia de anticuerpos.
El ensayo XTT se utiliza para medir la actividad metabólica celular como un indicador de viabilidad celular, proliferación celular y citotoxicidad20. Este ensayo colorimétrico se basa en la reducción de una sal amarilla de tetrazolio, 3′-[1-(fenililaminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis (4-metoxi-6-nitro) benceno sulfónico hidrato de ácido sulfónico (XTT) a un colorante formazán naranja por células metabólicamente activas. Dado que solo las células viables pueden reducir XTT, la cantidad de formazan XTT reducida es proporcional a la intensidad del color y la viabilidad celular. El colorante formazán formado es soluble en agua y se cuantifica directamente utilizando un lector de placas. Debido a su naturaleza soluble en agua, el ensayo XTT permite el estudio de biofilms intactos, así como el examen de la susceptibilidad a los medicamentos biofilm, sin interrupción de la estructura del biofilm21. Además, este método se implementa en las evaluaciones de viabilidad fúngica de Candida debido a su facilidad de uso, velocidad, precisión, alto rendimiento y alto grado de reproducibilidad 7,22.
Además del ensayo de reducción XTT, también se han identificado numerosas técnicas alternativas para la medición de la cantidad de biofilm. Algunos de estos incluyen el uso del ensayo de reducción de MTT, tinción de violeta cristalina, cuantificación de ADN, PCR cuantitativa, cuantificación de proteínas, medición del peso de células secas y conteo de colonias viables. Estos procedimientos varían ampliamente en términos de sus requisitos de tiempo y costo. Taff et al. realizaron un análisis comparativo de siete ensayos diferentes de cuantificación de biopelículas de Candida y encontraron que el ensayo XTT proporcionó el método más reproducible, preciso y eficiente para la estimación cuantitativa de biopelículas de C. albicans 23. Las técnicas de tinción como el cristal violeta tienen ciertas limitaciones; La prueba de violeta de cristal determina indirectamente la cantidad de biopelícula midiendo la densidad óptica de la matriz y las células de la biopelícula teñida de violeta de cristal. Aunque el ensayo de violeta cristalina proporciona una buena medida de la masa del biofilm, no da una medida de viabilidad del biofilm, ya que tiñe tanto las células microbianas como la matriz extracelular24. Dhale et al. informaron además que el ensayo de reducción XTT fue el método más sensible, reproducible, preciso, eficiente y específico para detectar la producción de biopelícula en comparación con el ensayo de violeta cristal25. Los informes de la literatura han demostrado que el ensayo XTT se correlaciona bien con el parámetro UFC/ml en el método de conteo de UFC. Sin embargo, en comparación con el ensayo XTT, el método CFU es laborioso y lento26. Además, la fracción de células vivas separadas puede no ser representativa de la población inicial de biofilm27. Aunque el ensayo de reducción XTT parece la mejor opción disponible para cuantificar la viabilidad, existen algunas limitaciones de esta técnica. Si bien el método XTT es útil para comparaciones que involucran una cepa de hongos, su uso puede ser limitado cuando se comparan diferentes cepas y especies de hongos. Las comparaciones entre cepas pueden ser difíciles en ausencia de una estandarización detallada, ya que diferentes cepas metabolizan sustratos con diferentes capacidades21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las infecciones fúngicas causadas por especies de Candida se asocian con altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La creciente amenaza de infección fúngica invasiva requiere el manejo temprano de tales enfermedades potencialmente mortales. La mayoría de las infecciones por Candida involucran la formación de biofilms, que se adhieren a una variedad de dispositivos médicos y son responsables de la persistencia y recurrencia de infecciones fúngicas en entornos hospitalarios<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención Ramalingaswami DBT-843-BIO (Departamento de Biotecnología, Gobierno de la India) y el Premio de Investigación de Carrera Temprana SER-1058-BIO (Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería, Gobierno de la India) a S.R. Los autores reconocen una subvención ICMR-JRF a P.C y una subvención DBT-JRF a P.S. Los autores agradecen al Dr. Ravikant Ranjan por las sugerencias sobre el manuscrito y la asistencia técnica del Sr. Pradeep Singh Thakur durante SEM.
Materials
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | – | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
| 96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
| Incubator | Generic | ||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate Reader | Generic | ||
| Multichannel pipette and tips | Generic | ||
| Petri dishes | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactate | – | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
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