עיקור קרינת גמא במינון נמוך עבור שתלי קנה נשימה דה-צלולריים
Summary
קבלת עיקור חיונית להשתלת רקמת קנה הנשימה. כאן אנו מציגים פרוטוקול עיקור באמצעות הקרנת גמא במינון נמוך הנסבל במלואו על ידי איברים.
Abstract
אחד ההיבטים המרכזיים העיקריים בהבטחת התפתחות נכונה של השתלה הוא הסטריליות של המדיום. השתלת קנה נשימה דה-צלולרי כרוכה בהשתלת איבר שהיה במקור במגע עם הסביבה, ולכן לא היה סטרילי מלכתחילה. בעוד פרוטוקול דה-צלולריזציה (באמצעות אקספוזיציה של חומרי ניקוי [2% נתרן דודציל סולפט], ערבוב מתמשך וזעזועים אוסמוטיים) מתבצע בהתאם לאמצעים אספטיים, הוא אינו מספק סטריליזציה. לכן, אחד האתגרים העיקריים הוא הבטחת סטריליות לפני השתלת in vivo . למרות שקיימים פרוטוקולים מבוססים לעיקור קרינת גמא עבור חומרים אנאורגניים, אין אמצעים כאלה עבור חומרים אורגניים. בנוסף, לא ניתן ליישם את הפרוטוקולים הקיימים עבור חומרים אנאורגניים על חומרים אורגניים, מכיוון שמנת הקרינה שנקבעה (25 kGy) תהרוס לחלוטין את השתל. מאמר זה בוחן את ההשפעה של מנת קרינה מוגברת בקנה הנשימה של ארנב נטול תאים. שמרנו על טווח המינונים (kGy) ובדקנו מינונים מוגברים עד שמצאנו את המינון המינימלי שבו מתבצע העיקור. לאחר קביעת המינון, חקרנו את ההשפעות שלו על האיבר, הן מבחינה היסטולוגית והן מבחינה ביומכנית. קבענו כי בעוד 0.5 kGy לא השיגו סטריליות, מינונים של 1 kGy ו 2 kGy כן, עם 1 kGy, אם כן, להיות המינון המינימלי הדרוש כדי להשיג עיקור. מחקרים מיקרוסקופיים לא הראו שינויים רלוונטיים בהשוואה לאיברים לא מעוקרים. מאפיינים ביומכניים ציריים לא השתנו כלל, ונצפתה רק ירידה קלה בכוח ליחידת אורך שהאיבר יכול לסבול רדיאלית. לפיכך אנו יכולים להסיק כי 1 kGy משיג עיקור מלא של קנה הנשימה ארנב decellularized עם השפעות מינימליות, אם בכלל, על האיבר.
Introduction
עיקור של שתל הוא תנאי בסיסי לכדאיותו; למעשה, תותבות שהוכחו כמוצלחות הן אלו שהושתלו באזורים סטריליים (כלי דם, לב, עצם וכו’). 1. לקנה הנשימה שני משטחים: משטח במגע עם הסביבה החיצונית, ולכן אינו סטרילי, ומשטח לכיוון המדיאסטינום, שהוא סטרילי. לכן, מרגע מיצוי קנה הנשימה, הוא אינו איבר סטרילי. למרות שתהליך הדה-צלולריזציה לאחר מכן מתבצע בתנאים סטריליים מקסימליים, זה לא שלבעיקור 2. השתלת חומר זר כשלעצמה כרוכה בסיכון לזיהום בשל המיקרו-סביבה הפרובקטריאלית שהיא מייצרת3וסיכון של עד 0.014% להעברת מחלות מהתורם למקבל, גם אם החומר עבר עיקור4. כדי להבטיח וסקולריזציה נכונה של קנה הנשימה, כמעט בכל פרוטוקולי ההשתלה הניסיוניים, הוא עובר תחילה שתל הטרוטופי 5,6,7 לאזור סטרילי (שריר, פאשיה, אומנטום, תת עורית וכו ‘); הסיבה לכך היא שהשתלת אלמנט לא סטרילי בתווך זה תוביל לזיהום של אזור3.
ישנן מגוון אסטרטגיות אפשריות להשגת שתל סטרילי. שימוש ב-CO2 סופר-קריטי השיג עיקור סופני 8,9. שיטות אחרות, כגון קרינה אולטרה סגולה או טיפול בחומרים כגון חומצה פראצטית, אתנול, חמצן חמצן ומים אלקטרוליזה, השיגו שיעורי הצלחה שונים בעיקור, כמעט תמיד בהתאם למינונים שלהם, אך הם הוכחו כמשפיעים על המאפיינים הביומכניים של שתלים. ואכן, חומרים מסוימים, כגון אתילן אוקסיד, יכולים לשנות באופן משמעותי את המבנה של המטריצה המושתלת ואף יכולים לגרום להשפעות אימונוגניות בלתי רצויות. מסיבה זו, רבות מהאסטרטגיות הללו אינן ניתנות ליישום על מודלים ביולוגיים 2,10,11,12,13.
אסטרטגיית העיקור הנחקרת והמקובלת ביותר היא זו שנקבעה על ידי תקן ISO 11737-1:2006 לעיקור מכשירים רפואיים המושתלים בבני אדם, עם מנת קרינת גמא של 25 kGy. עם זאת, תקנה זו מתמקדת רק בעיקור של יסודות אינרטיים, לא ביולוגיים14,15. בנוסף, מינוני הרדיותרפיה בטיפול רדיקלי בקרצינומה נמוכים בשלושה סדרי גודל מאלה המשמשים לעיקור מכשירים רפואיים1. בהתחשב בכך, אנו יכולים להסיק כי מינון זה לא רק יהרוג את המיקרוביוטה אלא גם יהרוס וישנה באופן קיצוני את המבנה הביולוגי של השתל. קיימת גם אפשרות שהוא ייצור שאריות שומנים בעת ההתפרקות, אשר עלולות להיות ציטוטוקסיות ולהאיץ את הפירוק האנזימטי של הפיגום 13,14,15,16,17, גם כאשר משתמשים במינונים נמוכים כמו 1.9 kGy ועם נזק ביחס ישר למנת הקרינה המתקבלת 17.
לפיכך, מטרת מאמר זה היא לנסות לזהות את מינון הקרינה המאפשר קבלת שתל סטרילי עם השפעות מזיקות מינימליות הנגרמות על ידי קרינה 2,18,19. האסטרטגיה שעקבנו אחריה כללה הקרנה של קנה נשימה נטול תאים ומוקרן במינונים מוגברים שונים בטווח של קילוגראים (0.5, 1, 2, 3 ק”ג וכו ‘), עד להשגת תרבית שלילית. בדיקות נוספות בוצעו עבור אותם מינונים שהשיגו תרביות שליליות, על מנת לאשר עיקור. לאחר קביעת המינון המינימלי להשגת עיקור, נבדקה ההשפעה המבנית והביומכנית של הקרינה על קנה הנשימה. כל המדדים הושוו לקנה הנשימה של הארנב הילידי של קבוצת הביקורת. העיקור של המבנה נבדק אז in vivo על ידי השתלת קנה הנשימה בארנבים לבנים בניו זילנד.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיימות מספר אסטרטגיות עיקור. CO2סופרקריטי חודר במלואו לרקמות, חומץ את התווך ומפרק את דו-שכבת הפוספוליפידים התאית באמצעות חיסול פשוט באמצעות דיכוי השתל 8,14,25. נעשה שימוש גם בקרינה אולטרה סגולה, ויעילותה בקנה הנשימה של מכרסם פורסמה, אם ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מאמר זה נתמך על ידי מענק האגודה הספרדית לניתוחי חזה לשנת 2018 למחקר רב-צנטרי לאומי [מספר 180101 הוענק לנסטור ג’יי מרטינז-הרננדס] ו-PI16-01315 [הוענק למנואל מאטה-רויג] על ידי מכון סאלוד קרלוס השלישי. CIBERER ממומנת על ידי תוכנית המו”פ הלאומית השישית 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions והמכון של סאלוד קרלוס השלישי, בסיוע הקרן האירופית לפיתוח אזורי.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch’ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories. Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
