Lavdosis gammastrålingssterilisering til decellulariserede trakealtransplantater
Summary
Opnåelse af sterilisering er afgørende for trakeal vævstransplantation. Heri præsenterer vi en steriliseringsprotokol ved hjælp af lavdosis gammabestråling, der tolereres fuldt ud af organer.
Abstract
Et af de vigtigste nøgleaspekter for at sikre, at en transplantation udvikler sig korrekt, er mediets sterilitet. Decellulariseret trakealtransplantation indebærer implantering af et organ, der oprindeligt var i kontakt med miljøet og dermed ikke var sterilt fra starten. Mens decellulariseringsprotokollen (gennem vaskemiddeludstilling [2% natriumdodecylsulfat], kontinuerlig omrøring og osmotiske chok) udføres i overensstemmelse med aseptiske foranstaltninger, giver den ikke sterilisering. Derfor er en af de største udfordringer at sikre sterilitet før in vivo-implantation . Selv om der er etableret gammastrålingssteriliseringsprotokoller for uorganiske materialer, er der ingen sådanne foranstaltninger for organiske materialer. Derudover kan protokollerne for uorganiske materialer ikke anvendes på organiske materialer, da den etablerede strålingsdosis (25 kGy) ville ødelægge implantatet fuldstændigt. Dette papir undersøger effekten af en eskaleret strålingsdosis i en decellulariseret kaninluftrør. Vi opretholdt dosisområdet (kGy) og testede eskalerede doser, indtil vi fandt den minimale dosis, hvor sterilisering opnås. Efter bestemmelse af dosis studerede vi virkningerne af det på organet, både histologisk og biomekanisk. Vi fastslog, at mens 0,5 kGy ikke opnåede sterilitet, gjorde doser på både 1 kGy og 2 kGy, hvor 1 kGy derfor var den minimale dosis, der var nødvendig for at opnå sterilisering. Mikroskopiske undersøgelser viste ingen relevante ændringer sammenlignet med ikke-steriliserede organer. Aksiale biomekaniske egenskaber blev slet ikke ændret, og kun en lille reduktion i kraften pr. Længdeenhed, som organet radialt kan tolerere, blev observeret. Vi kan derfor konkludere, at 1 kGy opnår fuldstændig sterilisering af decellulariseret kaninluftrør med minimale, hvis nogen, virkninger på organet.
Introduction
Sterilisering af et implantat er en grundlæggende forudsætning for dets levedygtighed; Faktisk er proteser, der har vist sig at være vellykkede, dem, der implanteres i sterile områder (blodkar, hjerte, knogler osv.) 1. Luftrøret har to overflader: en overflade i kontakt med det ydre miljø, som derfor ikke er steril, og en overflade mod mediastinum, som er steril. Derfor er det fra det øjeblik luftrøret ekstraheres, ikke et sterilt organ. På trods af at den efterfølgende decellulariseringsproces udføres under maksimale sterile forhold, er det ikke et steriliseringstrin2. Implantation af fremmedlegemer indebærer i sig selv en risiko for infektion på grund af det probakterielle mikromiljø, det producerer3og en op til 0,014% risiko for sygdomsoverførsel fra donor til modtager, selvom materialet er blevet steriliseret4. For at sikre korrekt vaskularisering af luftrøret gennemgår det i næsten alle eksperimentelle transplantationsprotokoller først heterotopisk implantat 5,6,7 til et sterilt område (muskel, fascia, omentum, subkutan osv.); Dette skyldes, at implantering af et ikke-sterilt element i dette medium ville føre til infektion i området3.
Der er en række mulige strategier til at opnå et sterilt implantat. Ved anvendelse af superkritisk CO2er der opnået terminal sterilisering 8,9. Andre metoder, såsom ultraviolet stråling eller behandling med stoffer som pereddikesyre, ethanol, iltperoxid og elektrolyseret vand, har opnået forskellige succesrater ved sterilisering, næsten altid afhængigt af deres doser, men de har vist sig at påvirke implantaternes biomekaniske egenskaber. Faktisk kan nogle stoffer, såsom ethylenoxid, væsentligt ændre strukturen af den implanterede matrix og kan endda forårsage uønskede immunogene virkninger. Af denne grund kan mange af disse strategier ikke anvendes på biologiske modeller 2,10,11,12,13.
Den mest undersøgte og accepterede steriliseringsstrategi er den, der er fastlagt i ISO 11737-1: 2006-standarden for sterilisering af medicinsk udstyr implanteret i mennesker med en gammastrålingsdosis på 25 kGy. Denne forordning fokuserer imidlertid kun på sterilisering af inerte, ikke-biologiske elementer14,15. Derudover er strålebehandlingsdoser i den radikale behandling af karcinom tre størrelsesordener lavere end dem, der anvendes til sterilisering af medicinsk udstyr1. Med dette i tankerne kan vi konkludere, at nævnte dosis ikke kun ville dræbe mikrobiotaen, men også ville ødelægge og radikalt ændre implantatets biologiske struktur. Der er også mulighed for, at det ville generere resterende lipider ved nedbrydning, som potentielt kan være cytotoksiske og fremskynde den enzymatiske nedbrydning af stilladset 13,14,15,16,17, selv når der anvendes doser så lave som 1,9 kGy og med skader direkte proportionale med den modtagne strålingsdosis 17.
Formålet med dette papir er således at forsøge at identificere den strålingsdosis, der gør det muligt at opnå et sterilt implantat med minimale skadelige virkninger forårsaget af bestråling 2,18,19. Den strategi, vi fulgte, involverede bestråling af decellulariserede og bestrålede luftrør i forskellige eskalerede doser inden for et interval af kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy osv.), Indtil der opnås en negativ kultur. Yderligere test blev udført for de doser, der opnåede negative kulturer, for at bekræfte sterilisering. Efter bestemmelse af minimumsdosis for at opnå sterilisering blev bestrålingens strukturelle og biomekaniske virkning på luftrøret kontrolleret. Alle målinger blev sammenlignet med kontrolindfødte kaninluftrør. Steriliseringen af konstruktionen blev derefter testet in vivo ved at implantere luftrøret i New Zealand hvide kaniner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der findes flere steriliseringsstrategier. Superkritisk CO2trænger fuldt ud ind i væv, forsurer mediet og dekonstruerer det cellulære phospholipid-dobbeltlag med simpel eliminering ved hjælp af trykaflastning af implantatet 8,14,25. Ultraviolet stråling er også blevet brugt, og dens effektivitet i gnaverluftrøret er blevet offentliggjort, selv om der kun er få rapporter i litteraturen10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette papir blev støttet af 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant to National Multicentric Study [Antal 180101 tildelt Néstor J.Martínez-Hernández] og PI16-01315 [tildelt Manuel Mata-Roig] af Instituto de Salud Carlos III. CIBERER finansieres af VI National F & D &I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions og Instituto de Salud Carlos III med bistand fra Den Europæiske Fond for Regionaludvikling.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch’ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B. Ultraviolet sterilization in microbiological laboratories. Public Health Reports. 71 (4), 331-336 (1956).
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
