Stérilisation par rayonnement gamma à faible dose pour les greffes trachéales décellularisées
Summary
L’obtention de la stérilisation est essentielle pour la greffe de tissu trachéal. Nous présentons ici un protocole de stérilisation utilisant une irradiation gamma à faible dose qui est entièrement tolérée par les organes.
Abstract
L’un des principaux aspects clés pour assurer l’évolution correcte d’une greffe est la stérilité du milieu. La transplantation trachéale décellularisée consiste à implanter un organe qui était à l’origine en contact avec l’environnement, n’étant donc pas stérile dès le départ. Bien que le protocole de décellularisation (par exposition au détergent [dodécylsulfate de sodium à 2%), agitation continue et chocs osmotiques) soit effectué conformément aux mesures aseptiques, il ne permet pas la stérilisation. Par conséquent, l’un des principaux défis est d’assurer la stérilité avant l’implantation in vivo . Bien qu’il existe des protocoles établis de stérilisation par rayonnement gamma pour les matières inorganiques, il n’existe pas de telles mesures pour les matières organiques. De plus, les protocoles en place pour les matières inorganiques ne peuvent pas être appliqués aux matières organiques, car la dose de rayonnement établie (25 kGy) détruirait complètement l’implant. Cet article étudie l’effet d’une dose de rayonnement accrue dans une trachée de lapin décellularisée. Nous avons maintenu la plage de doses (kGy) et testé les doses croissantes jusqu’à ce que nous trouvions la dose minimale à laquelle la stérilisation est réalisée. Après avoir déterminé la dose, nous en avons étudié les effets sur l’organe, à la fois histologiquement et biomécaniquement. Nous avons déterminé que même si 0,5 kGy n’atteignait pas la stérilité, des doses de 1 kGy et de 2 kGy l’étaient, 1 kGy étant donc la dose minimale nécessaire pour obtenir la stérilisation. Les études microscopiques n’ont montré aucun changement pertinent par rapport aux organes non stérilisés. Les caractéristiques biomécaniques axiales n’ont pas été modifiées du tout, et seule une légère réduction de la force par unité de longueur que l’organe peut tolérer radialement a été observée. Nous pouvons donc conclure que 1 kGy permet une stérilisation complète de la trachée de lapin décellularisée avec des effets minimes, voire nuls, sur l’organe.
Introduction
La stérilisation d’un implant est une condition de base pour sa viabilité; En fait, les prothèses qui ont fait leurs preuves sont celles implantées dans des zones stériles (vaisseaux sanguins, cœur, os, etc.) 1. La trachée a deux surfaces : une surface en contact avec le milieu extérieur, qui n’est donc pas stérile, et une surface vers le médiastin, qui est stérile. Par conséquent, à partir du moment où la trachée est extraite, ce n’est pas un organe stérile. Bien que le processus de décellularisation ultérieur soit effectué dans des conditions stériles maximales, il ne s’agit pas d’une étape de stérilisation2. L’implantation de corps étrangers entraîne en soi un risque d’infection en raison du microenvironnement probactérien qu’elle produit3et un risque de transmission de la maladie allant jusqu’à 0,014% du donneur au receveur, même si le matériel a été stérilisé4. Pour assurer une vascularisation correcte de la trachée, dans presque tous les protocoles de transplantation expérimentale, elle subit d’abord un implant hétérotopique 5,6,7 dans une zone stérile (muscle, fascia, épiploon, sous-cutané, etc.); En effet, l’implantation d’un élément non stérile dans ce milieu entraînerait une infection de la zone3.
Il existe une gamme de stratégies possibles pour obtenir un implant stérile. L’utilisation du CO2supercritique a permis d’obtenir une stérilisation terminale 8,9. D’autres méthodes, telles que le rayonnement ultraviolet ou le traitement avec des substances telles que l’acide peracétique, l’éthanol, le peroxyde d’oxygène et l’eau électrolysée, ont obtenu des taux de réussite différents dans la stérilisation, presque toujours en fonction de leurs dosages, mais il a été démontré qu’elles affectent les caractéristiques biomécaniques des implants. En effet, certaines substances, comme l’oxyde d’éthylène, peuvent modifier substantiellement la structure de la matrice implantée et peuvent même provoquer des effets immunogènes indésirables. Pour cette raison, bon nombre de ces stratégies ne peuvent pas être appliquées aux modèles biologiques 2,10,11,12,13.
La stratégie de stérilisation la plus étudiée et acceptée est celle établie par la norme ISO 11737-1:2006 pour la stérilisation des dispositifs médicaux implantés chez l’homme, avec une dose de rayonnement gamma de 25 kGy. Cependant, ce règlement se concentre uniquement sur la stérilisation des éléments inertes et non biologiques14,15. De plus, les doses de radiothérapie dans le traitement radical du carcinome sont inférieures de trois ordres de grandeur à celles utilisées pour stériliser les dispositifs médicaux1. Dans cette optique, nous pouvons conclure que ladite dose tuerait non seulement le microbiote, mais détruirait et modifierait radicalement la structure biologique de l’implant. Il est également possible qu’il génère des lipides résiduels lors de la dégradation, ce qui peut potentiellement être cytotoxique et accélérer la dégradation enzymatique de l’échafaudage 13,14,15,16,17, même en utilisant des doses aussi faibles que 1,9 kGy et avec des dommages directement proportionnels à la dose de rayonnement reçue 17.
Ainsi, l’objectif de cet article est d’essayer d’identifier la dose de rayonnement qui permet d’obtenir un implant stérile avec un minimum d’effets nocifs causés par l’irradiation 2,18,19. La stratégie que nous avons suivie impliquait l’irradiation de trachées décellularisées et irradiées à différentes doses accrues dans une gamme de kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.), jusqu’à obtenir une culture négative. Des tests supplémentaires ont été effectués pour les doses qui ont obtenu des cultures négatives, afin de confirmer la stérilisation. Après avoir déterminé la dose minimale pour obtenir la stérilisation, l’impact structurel et biomécanique de l’irradiation sur la trachée a été vérifié. Tous les paramètres ont été comparés avec les trachées de lapin indigènes témoins. La stérilisation de la construction a ensuite été testée in vivo en implantant les trachées dans des lapins blancs néo-zélandais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe plusieurs stratégies de stérilisation. LeCO2supercritique pénètre complètement dans les tissus, acidifiant le milieu et déconstruisant la bicouche phospholipide cellulaire par simple élimination par dépressurisation de l’implant 8,14,25. Le rayonnement ultraviolet a également été utilisé et son efficacité dans la trachée de rongeurs a été publiée, bien qu’il n’y ait que quelques rappor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cet article a été soutenu par la subvention 2018 de la Société espagnole de chirurgie thoracique à l’étude multicentrique nationale [numéro 180101 attribué à Néstor J.Martínez-Hernández] et PI16-01315 [décerné à Manuel Mata-Roig] par l’Instituto de Salud Carlos III. CIBERER est financé par le VI Plan national de R&D&I 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, le Programme de consolidation, les Actions CIBER et l’Instituto de Salud Carlos III, avec l’aide du Fonds européen de développement régional.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
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