脱細胞化気管移植片のための低線量ガンマ線滅菌
Summary
気管組織移植には滅菌が不可欠です。ここでは、臓器に完全に耐えられる低線量ガンマ線照射を使用した滅菌プロトコルを提示します。
Abstract
移植が正しく進化することを確実にするための主な重要な側面の1つは、培地の無菌性です。脱細胞化気管移植では、もともと環境と接触していた臓器を移植するため、最初から無菌ではありません。脱細胞化プロトコル(洗剤博覧会[2%ドデシル硫酸ナトリウム]、連続攪拌、浸透圧ショックによる)は無菌対策に沿って実施されますが、滅菌は提供されません。したがって、主な課題の1つは、 in vivo 移植前の無菌性を確保することです。無機材料には確立されたガンマ線滅菌プロトコルがありますが、有機材料にはそのような対策はありません。さらに、確立された放射線量(25 kGy)はインプラントを完全に破壊するため、無機材料に対して実施されているプロトコルを有機材料に適用することはできません。この論文は、脱細胞化ウサギ気管における放射線量の増加の影響を研究しています。用量範囲(kGy)を維持し、滅菌が達成される最小用量が見つかるまで、漸増用量をテストしました。用量を決定した後、組織学的および生体力学的に臓器への影響を研究しました。0.5 kGyは無菌性を達成しなかったが、1 kGyと2 kGyの両方の用量は無菌性を達成し、したがって1 kGyが滅菌を達成するために必要な最小用量であると判断した。顕微鏡研究では、滅菌されていない臓器と比較して関連する変化は示されませんでした。軸方向の生体力学的特性はまったく変化せず、臓器が放射状に耐えることができる単位長さあたりの力のわずかな減少のみが観察されました。したがって、1 kGyは、臓器への影響が最小限であるとしても、脱細胞化ウサギ気管の完全な滅菌を達成すると結論付けることができます。
Introduction
インプラントの滅菌は、その実行可能性の基本的な必要条件です。実際、成功していることが証明されているプロテーゼは、無菌領域(血管、心臓、骨など)に埋め込まれたものです。1.気管には、外部環境と接触する表面(したがって無菌ではない)と縦隔に向かう表面(無菌)の2つの表面があります。したがって、気管が抜去された瞬間から、それは無菌臓器ではありません。その後の脱細胞化プロセスが最大の無菌条件下で行われているにもかかわらず、それは滅菌工程2ではない。異物の移植自体は、それが生成する細菌微小環境による感染のリスクを伴います3 そして、材料が滅菌されていても、ドナーからレシピエントへの病気の伝染のリスクは最大0.014%です4。気管の正しい血管新生を確実にするために、ほとんどすべての実験的移植プロトコルにおいて、それは最初に無菌領域(筋肉、筋膜、大網、皮下など)に異所性インプラント5,6,7を受ける。これは、この培地に非滅菌要素を移植すると、領域3の感染につながるためです。
滅菌インプラントを得るための可能な戦略の範囲があります。超臨界CO2を用いて、最終滅菌8,9を達成した。紫外線照射や過酢酸、エタノール、過酸化酸素、電解水などの物質による処理などの他の方法は、ほとんどの場合、投与量に応じて滅菌の成功率が異なりますが、インプラントの生体力学的特性に影響を与えることが示されています。実際、エチレンオキシドなどのいくつかの物質は、移植されたマトリックスの構造を実質的に変化させる可能性があり、望ましくない免疫原性効果を引き起こす可能性さえあります。このため、これらの戦略の多くは、生物学的モデル2、10、11、12、13には適用できない。
最も広く研究され受け入れられている滅菌戦略は、ガンマ線量25 kGyのヒトに埋め込まれた医療機器の滅菌に関するISO 11737-1:2006規格によって確立されたものです。しかしながら、この規制は、不活性な非生物学的要素の滅菌にのみ焦点を当てている14,15。さらに、癌腫の根治的治療における放射線療法の線量は、医療機器の滅菌に使用される線量よりも3桁低くなっています1。これを念頭に置いて、上記の用量は微生物叢を殺すだけでなく、インプラントの生物学的構造を破壊し、根本的に変えると結論付けることができます。また、分解時に残留脂質を生成する可能性があり、これは細胞毒性があり、1.9 kGyという低い線量を使用し、受けた放射線量に正比例する損傷を伴う場合でも、足場13,14,15,16,17の酵素分解を加速する可能性があります17。
したがって、この論文の目的は、照射によって引き起こされる有害な影響を最小限に抑えて滅菌インプラントを得ることを可能にする放射線量を特定しようとすることです2,18,19。私たちが従った戦略は、負の培養を達成するまで、キログレイの範囲(0.5、1、2、3 kGyなど)内の異なるエスカレート線量で脱細胞化および照射された気管の照射を含みました。滅菌を確認するために、陰性培養を達成した用量について追加の試験を行った。滅菌を得るための最小線量を決定した後、気管に対する照射の構造的および生体力学的影響をチェックした。すべての測定基準を対照のネイティブウサギ気管と比較した。次に、構築物の滅菌を、気管をニュージーランドの白ウサギに移植することによってin vivoでテストしました。
Protocol
Representative Results
Discussion
存在するいくつかの滅菌戦略があります。超臨界CO2は組織に完全に浸透し、培地を酸性化し、インプラントの減圧による単純な除去で細胞リン脂質二重層を分解する8、14、25。紫外線も使用されており、げっ歯類の気管におけるその有効性は発表されているが、文献10には少数の報告しかない。使…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この論文は、2018年のスペイン胸部外科学会の全国多中心研究助成金[ネストルJ.マルティネスエルナンデスに授与された番号180101]およびPI16-01315[マヌエルマタロイグに授与]によってサポートされました。CIBERERは、欧州地域開発基金の支援を受けて、VI National R&D&I PLAN 2018-2011、Iniciativa Ingenio 2010、Consolider Program、CIBER Actions、Instituto de Salud Carlos IIIから資金提供を受けています。
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
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