탈세포화된 기관 이식편을 위한 저선량 감마선 멸균
Summary
기관 조직 이식에는 멸균이 필수적입니다. 여기에서 우리는 장기가 완전히 견딜 수 있는 저선량 감마선 조사를 사용하는 멸균 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
이식이 올바르게 진행되도록하는 주요 측면 중 하나는 배지의 무균 성입니다. 탈세포화된 기관 이식은 원래 환경과 접촉하여 처음부터 무균이 되지 않은 장기를 이식하는 것을 포함합니다. 탈세포화 프로토콜(세제 노출[2% 도데실황산나트륨], 연속 교반 및 삼투압 충격을 통해)은 무균 조치에 따라 수행되지만 살균을 제공하지는 않습니다. 따라서 주요 과제 중 하나는 생체 내 이식 전에 무균성을 보장하는 것입니다. 무기 물질에 대한 감마선 멸균 프로토콜이 확립되어 있지만 유기 물질에 대한 그러한 조치는 없습니다. 또한, 확립된 방사선량(25kGy)이 임플란트를 완전히 파괴할 수 있기 때문에 무기 재료에 대한 프로토콜을 유기 재료에 적용할 수 없습니다. 이 논문은 탈세포화된 토끼 기관에서 증가된 방사선량의 영향을 연구합니다. 우리는 용량 범위(kGy)를 유지하고 멸균이 달성되는 최소 용량을 찾을 때까지 증량된 용량을 테스트했습니다. 복용량을 결정한 후, 우리는 조직 학적으로나 생체 역학적으로 장기에 미치는 영향을 연구했습니다. 우리는 0.5kGy가 무균을 달성하지 못했지만 1kGy와 2kGy의 용량은 모두 달성했으며 따라서 1kGy는 멸균을 달성하는 데 필요한 최소 용량이라고 결정했습니다. 현미경 연구는 멸균되지 않은 장기와 비교하여 관련 변화를 나타내지 않았습니다. 축 방향 생체 역학적 특성은 전혀 변경되지 않았으며 기관이 방사상으로 견딜 수있는 단위 길이당 힘의 약간만 감소했습니다. 따라서 우리는 1 kGy가 장기에 미치는 영향을 최소화하면서 탈세포 화 된 토끼 기관의 완전한 살균을 달성한다고 결론 지을 수 있습니다.
Introduction
임플란트의 살균은 생존력을위한 기본 요건입니다. 실제로 성공한 것으로 입증 된 보철물은 멸균 부위 (혈관, 심장, 뼈 등)에 이식 된 보철물입니다. 1. 기관은 두 개의 표면을 가지고 있습니다 : 외부 환경과 접촉하는 표면은 멸균되지 않으며, 다른 표면은 멸균 된 종격동을 향한 표면입니다. 따라서 기관이 추출되는 순간부터 멸균 기관이 아닙니다. 후속 탈세포화 공정이 최대 멸균 조건에서 수행됨에도 불구하고, 이는 멸균 단계2가 아니다. 이물질의 주입 자체는 그것이 생산하는 프로박테리아 미세환경으로 인한 감염의 위험을 수반한다3그리고 물질이 멸균된 경우에도 기증자로부터 수혜자에게 질병이 전파될 위험이 최대 0.014%에 달한다4. 기관의 올바른 혈관 형성을 보장하기 위해 거의 모든 실험적 이식 프로토콜에서 먼저 무균 부위(근육, 근막, 망막, 피하 등)에 이종 성 임플란트 5,6,7을 거칩니다. 이 배지에 비멸균 요소를 주입하면 영역3의 감염으로 이어질 수 있기 때문입니다.
멸균 임플란트를 얻기 위한 다양한 가능한 전략이 있습니다. 초임계CO2를 사용하여 말단 멸균 8,9를 달성하였다. 자외선 또는 과초산, 에탄올, 과산화산소 및 전해수와 같은 물질로 처리하는 것과 같은 다른 방법은 거의 항상 복용량에 따라 멸균 성공률이 다르지만 임플란트의 생체역학적 특성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 실제로, 에틸렌 옥사이드와 같은 일부 물질은 주입된 매트릭스의 구조를 실질적으로 변화시킬 수 있고, 심지어 바람직하지 않은 면역원성 효과를 야기할 수 있다. 이러한 이유로, 이들 전략들 중 다수는 생물학적 모델(2,10,11,12,13)에 적용될 수 없다.
가장 널리 연구되고 인정되는 멸균 전략은 감마선 선량이 25kGy인 인간에게 이식된 의료 기기의 멸균에 대한 ISO 11737-1:2006 표준에 의해 수립된 전략입니다. 그러나이 규정은 불활성, 비 생물학적 요소14,15의 살균에만 초점을 맞추고 있습니다. 또한, 근치적 암종 치료에서 방사선 요법 선량은 의료기기 멸균에 사용되는 선량보다 3배 더 낮다1. 이를 염두에두고, 우리는 상기 용량이 미생물을 죽일뿐만 아니라 임플란트의 생물학적 구조를 파괴하고 근본적으로 변화시킬 것이라고 결론 지을 수 있습니다. 또한 분해시 잔류 지질을 생성할 가능성이 있으며, 이는 잠재적으로 세포독성을 가질 수 있고 스캐폴드(13,14,15,16,17)의 효소적 분해를 가속화할 수 있으며, 이는 1.9 kGy만큼 낮은 선량을 사용하고 방사선량에 정비례하는 손상을 입는 경우에도 마찬가지이다 17.
따라서, 본 논문의 목적은 방사선 조사에 의해 야기되는 최소한의 유해한 영향으로 멸균 임플란트가 얻어질 수 있도록 하는 방사선량을 확인하려고 시도하는 것이다 2,18,19. 우리가 따랐던 전략은 부정적인 배양을 달성할 때까지 킬로그레이 범위(0.5, 1, 2, 3kGy 등) 내에서 다양한 증량량으로 탈세포화 및 조사된 기관을 조사하는 것이었습니다. 살균을 확인하기 위해 음성 배양을 달성 한 용량에 대해 추가 테스트가 수행되었습니다. 멸균을 얻기위한 최소 선량을 결정한 후, 기관에 대한 조사의 구조적 및 생체 역학적 영향을 점검 하였다. 모든 메트릭을 대조군 토착 토끼 기관과 비교했습니다. 이어서, 구조물의 살균을 뉴질랜드 백색 토끼에 기관을 이식함으로써 생체 내에서 시험하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
존재하는 몇 가지 살균 전략이 있습니다. 초임계 CO2는 조직을 완전히 관통하여 배지를 산성화하고 임플란트 8,14,25의 감압에 의한 간단한 제거로 세포 인지질 이중층을 분해합니다. 자외선도 사용되어 왔으며 설치류 기관에서의 효과가 발표되었지만 문헌10에는 몇 가지 보고서 만 있습니다. 사용된 다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 논문은 2018년 스페인 흉부외과 학회(Spanish Society of Thoracic Surgery)의 지원을 받아 국립 다중심 연구(National Multicentric Study)[Néstor J.Martínez-Hernández에게 수여된 180101번] 및 Instituto de Salud Carlos III의 PI16-01315[Manuel Mata-Roig에게 수여됨]의 지원을 받았습니다. CIBERER는 VI National R & D & I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions 및 Instituto de Salud Carlos III의 지원을 받아 유럽 지역 개발 기금 (European Regional Development Fund)의 지원을 받고 있습니다.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
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