Niedrigdosis-Gammastrahlen-Sterilisation für dezellularisierte Trachealtransplantate
Summary
Die Sterilisation ist für die Transplantation von Trachealgewebe unerlässlich. Hier stellen wir ein Sterilisationsprotokoll mit niedrig dosierter Gammastrahlung vor, das von den Organen voll verträglich ist.
Abstract
Einer der wichtigsten Schlüsselaspekte, um sicherzustellen, dass sich ein Transplantat korrekt entwickelt, ist die Sterilität des Mediums. Bei der dezellularisierten Trachealtransplantation wird ein Organ implantiert, das ursprünglich mit der Umwelt in Kontakt stand und somit nicht von vornherein steril war. Während das Dezellularisierungsprotokoll (durch Detergenzienexposition [2% Natriumdodecylsulfat], kontinuierliches Rühren und osmotische Schocks) im Einklang mit aseptischen Maßnahmen durchgeführt wird, sieht es keine Sterilisation vor. Eine der größten Herausforderungen besteht daher darin, die Sterilität vor der In-vivo-Implantation sicherzustellen. Obwohl es etablierte Gammastrahlungs-Sterilisationsprotokolle für anorganische Materialien gibt, gibt es keine solchen Maßnahmen für organische Materialien. Darüber hinaus können die für anorganische Materialien geltenden Protokolle nicht auf organische Materialien angewendet werden, da die festgelegte Strahlendosis (25 kGy) das Implantat vollständig zerstören würde. In dieser Arbeit wird die Wirkung einer erhöhten Strahlendosis in einer dezellularisierten Kaninchenluftröhre untersucht. Wir behielten den Dosisbereich (kGy) bei und testeten eskalierte Dosen, bis wir die minimale Dosis gefunden hatten, bei der die Sterilisation erreicht wird. Nachdem wir die Dosis bestimmt hatten, untersuchten wir die Auswirkungen auf das Organ, sowohl histologisch als auch biomechanisch. Wir stellten fest, dass 0,5 kGy zwar keine Sterilität erreichten, Dosen von 1 kGy und 2 kGy jedoch schon, wobei 1 kGy daher die minimale Dosis war, die für die Sterilisation erforderlich war. Mikroskopische Untersuchungen zeigten keine relevanten Veränderungen im Vergleich zu nicht sterilisierten Organen. Die axialen biomechanischen Eigenschaften wurden überhaupt nicht verändert, und es wurde nur eine geringe Verringerung der Kraft pro Längeneinheit beobachtet, die das Organ radial tolerieren kann. Wir können daher schlussfolgern, dass 1 kGy eine vollständige Sterilisation der dezellularisierten Kaninchenluftröhre mit minimalen, wenn überhaupt, Auswirkungen auf das Organ erreicht.
Introduction
Die Sterilisation eines Implantats ist eine Grundvoraussetzung für seine Lebensfähigkeit. Tatsächlich haben sich Prothesen bewährt, die in sterilen Bereichen (Blutgefäße, Herz, Knochen usw.) implantiert wurden. 1. Die Luftröhre hat zwei Oberflächen: eine Oberfläche in Kontakt mit der äußeren Umgebung, die daher nicht steril ist, und eine Oberfläche zum Mediastinum hin, die steril ist. Daher ist die Luftröhre ab dem Moment, in dem sie entnommen wird, kein steriles Organ. Obwohl der anschließende Dezellularisierungsprozess unter maximal sterilen Bedingungen durchgeführt wird, handelt es sich nicht um einen Sterilisationsschritt2. Die Implantation von Fremdmaterial an sich birgt aufgrund der probakteriellen Mikroumgebung, diees erzeugt,ein Infektionsrisiko 3 und ein Risiko von bis zu 0,014 % der Krankheitsübertragung vom Spender auf den Empfänger, selbst wenn das Material sterilisiert wurde4. Um eine korrekte Vaskularisierung der Luftröhre zu gewährleisten, wird sie in fast allen experimentellen Transplantationsprotokollen zunächst einer heterotopen Implantation 5,6,7 in einen sterilen Bereich (Muskel, Faszien, Omentum, subkutan usw.) unterzogen. Dies liegt daran, dass die Implantation eines nicht sterilen Elements in dieses Medium zu einer Infektion des Bereichs3 führen würde.
Es gibt eine Reihe möglicher Strategien, um ein steriles Implantat zu erhalten. Durch die Verwendung von überkritischemCO2wurde eine terminale Sterilisation 8,9 erreicht. Andere Methoden, wie z. B. ultraviolette Strahlung oder die Behandlung mit Substanzen wie Peressigsäure, Ethanol, Sauerstoffperoxid und elektrolysiertem Wasser, haben unterschiedliche Erfolgsraten bei der Sterilisation erzielt, die fast immer von ihrer Dosierung abhängen, aber es hat sich gezeigt, dass sie die biomechanischen Eigenschaften von Implantaten beeinflussen. In der Tat können einige Substanzen, wie z. B. Ethylenoxid, die Struktur der implantierten Matrix erheblich verändern und sogar unerwünschte immunogene Wirkungen hervorrufen. Aus diesem Grund können viele dieser Strategien nicht auf biologische Modelle 2,10,11,12,13 angewendet werden.
Die am weitesten untersuchte und akzeptierte Sterilisationsstrategie ist die in der Norm ISO 11737-1:2006 festgelegte Sterilisationsstrategie für die Sterilisation von Medizinprodukten, die in Menschen implantiert wurden, mit einer Gammastrahlendosis von 25 kGy. Diese Vorschrift konzentriert sich jedoch nur auf die Sterilisation von inerten, nicht-biologischen Elementen14,15. Darüber hinaus sind die Strahlentherapiedosen bei der radikalen Behandlung von Karzinomen um drei Größenordnungen niedriger als bei der Sterilisation von Medizinprodukten1. Vor diesem Hintergrund können wir schlussfolgern, dass diese Dosis nicht nur die Mikrobiota abtöten, sondern auch die biologische Struktur des Implantats zerstören und radikal verändern würde. Es besteht auch die Möglichkeit, dass es beim Abbau Restlipide erzeugt, die potenziell zytotoxisch sein und den enzymatischen Abbau des Gerüstsbeschleunigen können 13,14,15,16,17, selbst wenn Dosen von nur 1,9 kGy verwendet werden und die Schädigung direkt proportional zur erhaltenen Strahlendosis ist 17.
Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, zu versuchen, die Strahlendosis zu identifizieren, die es ermöglicht, ein steriles Implantat mit minimalen schädlichen Auswirkungen durch Bestrahlung zu erhalten 2,18,19. Die Strategie, die wir verfolgten, beinhaltete die Bestrahlung von dezellularisierten und bestrahlten Luftröhren mit unterschiedlich eskalierten Dosen innerhalb eines Bereichs von Kilogray (0,5, 1, 2, 3 kGy usw.), bis eine negative Kultur erreicht wurde. Für die Dosen, die negative Kulturen erreichten, wurden zusätzliche Tests durchgeführt, um die Sterilisation zu bestätigen. Nach der Bestimmung der Mindestdosis für die Sterilisation wurden die strukturellen und biomechanischen Auswirkungen der Bestrahlung auf die Luftröhre überprüft. Alle Metriken wurden mit den kontrollierten einheimischen Kaninchentracheen verglichen. Die Sterilisation des Konstrukts wurde dann in vivo getestet, indem die Luftröhren in neuseeländische weiße Kaninchen implantiert wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt verschiedene Sterilisationsstrategien. Überkritisches CO2dringt vollständig in das Gewebe ein, säuert das Medium an und dekonstruiert die zelluläre Phospholipiddoppelschicht mit einfacher Eliminierung durch Druckentlastung des Implantats 8,14,25. Ultraviolette Strahlung wurde ebenfalls verwendet, und ihre Wirksamkeit in der Luftröhre von Nagetieren wurde veröffentlicht, obwohl es nur wenige Berichte in d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant to National Multicentric Study [Nummer 180101 vergeben an Néstor J. Martínez-Hernández] und PI16-01315 [verliehen an Manuel Mata-Roig] vom Instituto de Salud Carlos III. CIBERER wird durch den VI. Nationalen F&E&I-Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, das Consolider-Programm, CIBER Actions und das Instituto de Salud Carlos III mit Unterstützung des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung finanziert.
Materials
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole) | DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA | D9542 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Fischer Scientific, Madrid, Spain | 12678646 | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
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