एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो निकट-अवरक्त फेम्टोसेकंड लेजर का उपयोग करके मेटाफ़ेज़ I के दौरान माउस अंडाणुओं में साइटोप्लाज्मिक सूक्ष्मनलिका आयोजन केंद्रों की कमी को सक्षम बनाता है।
विकासात्मक रूप से सक्षम यूप्लोइड अंडे उत्पन्न करने के लिए अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन की निष्ठा महत्वपूर्ण है। स्तनधारियों में, अंडाणु पहले मियोटिक विभाजन के प्रोफ़ेज़ I पर एक लंबी गिरफ्तारी से गुजरता है। युवावस्था के बाद और मियोटिक बहाली पर, परमाणु झिल्ली अलग हो जाती है (परमाणु लिफाफा टूटना), और धुरी मुख्य रूप से अंडाणु केंद्र में इकट्ठा होती है। असामान्य किनेटोकोर-माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी) संलग्नक और एन्यूप्लोइडी से बचाने के लिए प्रारंभिक केंद्रीय स्पिंडल पोजिशनिंग आवश्यक है। केंद्रीय रूप से तैनात स्पिंडल कॉर्टेक्स की ओर समय-संवेदनशील तरीके से स्थानांतरित होता है, और यह एक छोटे ध्रुवीय शरीर को बाहर निकालने के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है। माइटोटिक कोशिकाओं में, स्पिंडल पोजिशनिंग सेंट्रोसोम-मध्यस्थता वाले सूक्ष्म एमटी और सेल कॉर्टेक्स के बीच बातचीत पर निर्भर करती है। इसके विपरीत, माउस अंडाणुओं में क्लासिक सेंट्रोसोम की कमी होती है और इसके बजाय, इसमें कई एसेंट्रिओलर एमटी आयोजन केंद्र (एमटीओसी) होते हैं। मेटाफ़ेज़ I चरण में, माउस ओसाइट्स में एमटीओसी के दो अलग-अलग सेट होते हैं: (1) एमटीओसी जो स्पिंडल पोल (ध्रुवीय एमटीओसी) को इकट्ठा करने के लिए क्लस्टर और क्रमबद्ध होते हैं, और (2) मेटाफ़ेज़ साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी (एमसीएमटीओसी) जो साइटोप्लाज्म में रहते हैं और सीधे स्पिंडल गठन में योगदान नहीं करते हैं लेकिन स्पिंडल पोजिशनिंग और समय पर स्पिंडल माइग्रेशन को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां, एक मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन विधि को सीईपी 192-ईजीएफपी रिपोर्टर चूहों से एकत्र किए गए अंडाणुओं में चुनिंदा अंतर्जात रूप से लेबल किए गए एमसीएमटीओसी को कम करने के लिए वर्णित किया गया है। यह विधि स्तनधारी अंडाणुओं में स्पिंडल पोजिशनिंग और माइग्रेशन को अंतर्निहित आणविक तंत्र की समझ में योगदान देती है।
अगुणित युग्मक (शुक्राणु और अंडाणु) अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, जिसमें डीएनए प्रतिकृति का एक दौर होता है, जिसके बाद दो लगातार विभाजन होते हैं जो निषेचन से पहले गुणसूत्र संख्या में कमी के लिए आवश्यक होते हैं। स्तनधारियों में, प्रारंभिक भ्रूण के जीवन के दौरान, अंडाणु पहले मियोटिक विभाजन के प्रोफ़ेज़ I के डिप्लोटेन चरण में एक लंबी गिरफ्तारी (यौवन तक) से गुजरता है, एक चरण जिसे जर्मिनल पुटिका (जीवी) चरण कहा जाता है। मियोटिक बहाली के बाद, जीवी अंडाणु परमाणु लिफाफा टूटने (एनईबीडी) से गुजरता है, और स्पिंडल को मुख्य रूप से अंडाणु केंद्र 1,2,3 पर इकट्ठा किया जाता है। बाद में, एफ-एक्टिन द्वारा संचालित, स्पिंडल अत्यधिक विषम विभाजन सुनिश्चित करने के लिए अंडाणु केंद्र से कॉर्टेक्स में समय-समय पर स्थानांतरित हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक छोटे ध्रुवीय शरीर (पीबी) 4,5,6 के साथ एक अंडा होता है।
माइटोटिक कोशिकाओं में, सेंट्रोसोम में पेरी-सेंट्रीओलर सामग्री घटकों (पीएमसी) से घिरे सेंट्रीओल्स की एक जोड़ी होती है, जैसे कि पेरिसेंट्रिन, γ-ट्यूबुलिन, सीईपी 152, और सीईपी 1927। ये सेंट्रीओल युक्त सेंट्रोसोम द्विध्रुवी स्पिंडल गठन की निष्ठा में योगदान करतेहैं। हालांकि, कृंतकों सहित विभिन्न प्रजातियों में प्रारंभिक ओजेनेसिस के दौरान सेंट्रीओल्सखो जाते हैं। इसलिए, माउस ओसाइट्स कई एसेंट्रिओलर माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी) आयोजन केंद्रों (एमटीओसी) 9,10 का उपयोग करके एक सेंट्रीओल-स्वतंत्र स्पिंडल असेंबली मार्ग को अपनाते हैं। मायोटिक बहाली पर, पेरिन्यूक्लियर एमटीओसी बड़ी संख्या में छोटे एमटीओसी11,12 में पुन: संघनन, खिंचाव और विखंडन के तीन अलग-अलग चरणों से गुजरते हैं। खंडित एमटीओसी को तब द्विध्रुवीय स्पिंडल10,13,14 को व्यवस्थित करने के लिए समूहित और क्रमबद्ध किया जाता है। एमटीओसी का एक और पूल एनईबीडी के दौरान साइटोप्लाज्म में स्थित है। इनमें से कुछ साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी प्रवास करते हैं और स्पिंडल पोल (ध्रुवीय एमटीओसी, पीएमटीओसी) 10,11 बनाते हैं। हाल ही में, साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी के एक और उप-समूह की खोज की गई थी, जिसे मेटाफ़ेज़ साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी (एमसीएमटीओसी) कहा जाता है, जो स्पिंडल पोल गठन में योगदान नहीं करते हैं लेकिन मेटाफ़ेज़ आई (मेट आई) 15 के दौरान अंडाणु साइटोप्लाज्म में रहते हैं। मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन द्वारा एमसीएमटीओसी को कम करना या ऑटोफैगी अवरोध द्वारा असामान्य रूप से उनकी संख्या में वृद्धि स्पिंडल पोजिशनिंग और माइग्रेशन कोपरेशान करती है और मेटाफेज II अंडाणुओं में एन्यूप्लोइडी की घटनाओं को बढ़ाती है।
दिलचस्प बात यह है कि एमसीएमटीओसी कई पहलुओं में पीएमटीओसी से भिन्न होतेहैं। उदाहरण के लिए, पीएमटीओसी के विपरीत, जो मुख्य रूप से पेरिन्यूक्लियर एमटीओसी से उत्पन्न होते हैं, एमसीएमटीओसी अंडाणु कॉर्टेक्स से उत्पन्न होते हैं। जब स्पिंडल अभी भी अंडाणु केंद्र में होता है, तो एमसीएमटीओसी उस पक्ष के विपरीत स्थानीयकृत होते हैं जिस पर स्पिंडल पीबी एक्सट्रूज़न15 के लिए स्थानांतरित होता है। सूक्ष्म जैसे एमटी अपेक्षाकृत बड़े अंडाणु कोशिका में कॉर्टेक्स तक नहीं पहुंच सकते हैं। इसलिए, ये एमसीएमटीओसी स्पिंडल (सूक्ष्म जैसे एमटीओसी के माध्यम से ) को कॉर्टेक्स में लंगर डालने के लिए एमटी को न्यूक्लियेट करते हैं। ये निष्कर्ष एक मॉडल का सुझाव देते हैं जिसमें एमसीएमटीओसी-न्यूक्लियेटेड एमटी बल एफ-एक्टिन-मध्यस्थता बल का मुकाबला करता है जो कॉर्टेक्स की ओर स्पिंडल माइग्रेशन को चलाता है। इन दो विरोधी बलों के बीच संतुलन केंद्रीय स्पिंडल पोजिशनिंग और समय पर स्पिंडल माइग्रेशनको विनियमित करने के लिए आवश्यक है।
आज तक, सभी जांच किए गए पीएमसी प्रोटीन (पेरिसेंट्रिन, जी-ट्यूबुलिन, सीईपी 192, और ऑरोरा काइनेज ए) एमटीओसी पूल दोनों के लिए स्थानीयकृत हैं: एमसीएमटीओसी और पीएमटीओसी15। इसलिए, पीएमटीओसी को परेशान किए बिना चुनिंदा रूप से एमसीटीओसी को परेशान करने के लिए कोई रासायनिक या आनुवंशिक दृष्टिकोण नहीं है। लेजर एब्लेशन के साथ चुनिंदा रूप से एमसीएमटीओसी को लक्षित करके इन सीमाओं को दरकिनार किया जा सकता है। माइक्रोएबलेशन के लिए विकसित लेजर-आधारित प्रौद्योगिकियों में, स्पंदित मल्टी-फोटॉन फेम्टोसेकंड लेजर फोकल प्लेन तक सीमित उनके सटीक प्रभाव, निकट-अवरक्त प्रकाश की उच्च प्रवेश गहराई और सेल को कम फोटोटॉक्सिसिटी और थर्मल क्षतिके कारण बड़ी क्षमता दिखाते हैं। यह काम एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ युग्मित मल्टी-फोटॉन लेजर का उपयोग करके माउस ओसाइट्स में एमसीएमटीओसी को हटाने के लिए एक चयनात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करता है।
कोशिकाओं22,23,24,25 के भीतर साइटोस्केलेटन से संबंधित संरचनाओं को परेशान करने के लिए विभिन्न तरीके मौजूद हैं। हालांकि, सेल व्यवहार्यता से समझौता किए बिना लक्षित संरचना को चुनिंदा रूप से परेशान करने के लिए कुशल तकनीकों को ढूंढना चुनौतीपूर्ण है। यहां प्रस्तुत मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन विधि अंडाणु व्यवहार्यता को बदले बिना अंडाणु के भीतर एमसीएमटीओसी के लिए चयनात्मक यांत्रिक गड़बड़ी को प्रेरित करने के लिए एक कुशल रणनीति है।
माइटोसिस और अर्धसूत्रीविभाजन22,23,26,27 के दौरान गुणसूत्र अलगाव को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को समझने के लिए लेजर एब्लेशन का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। दैहिक कोशिकाओं 28 की तुलना में स्तनधारी अंडाणुओं के अपेक्षाकृत बड़े आकार (>80 मिमी व्यास) के कारण, उनकी इंट्रासेल्युलर संरचनाओं का पृथक्करण एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, मेटाफ़ेज़ आई ओसाइट्स में औसत एमसीएमटीओसी मात्रा ~ 20 μm15 है, जो एक अतिरिक्त चुनौती का प्रतिनिधित्व करती है। इन चुनौतियों को दूर करने के लिए एक कुशल तरीका अपनाया जाना चाहिए जो गहरी ऊतक प्रवेश प्रदान करता है। एब्लेशन के लिए मल्टी-फोटॉन लेजर का उपयोग करने का मुख्य लाभ ऑफ-टारगेट प्रभाव29 को कम करते हुए सेल में गहराई तक पहुंचने की क्षमता है।
लक्षित संरचना को कम करने के लिए लेजर एब्लेशन विधि की प्रभावकारिता और दक्षता को सत्यापित करने के लिए, समय के साथ लक्षित संरचना की पहचान करने के लिए एक फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (एब्लेशन से पहले और बाद में)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लेजर एब्लेशन एक संरचना के रूप में पूरे एमसीएमटीओसी को कम करता है, और हालांकि छोटे एमसीएमटीओसी को समाप्त होने के लिए केवल एक लेजर एक्सपोजर की आवश्यकता होती है, बड़े एमसीएमटीओसी को विभिन्न फोकल विमानों में एक से अधिक लेजर एक्सपोजर की आवश्यकता हो सकती है। एमसीएमटीओसी एब्लेशन की दक्षता की पुष्टि करने के लिए एमटीओसी मार्कर (जैसे γ-ट्यूबुलिन, पेरिसेंट्रिन, या सीईपी 192) के साथ नियंत्रण और एमसीएमटीओसी-एब्लेटेड ओसाइट्स के एक उप-समूह को ठीक करने और इम्यूनोलेबल करने की भी सिफारिश की जाती है। नियंत्रण अंडाणुओं में, साइटोप्लाज्म के क्षेत्रों को एमसीएमटीओसी के साथ निकट लेकिन अतिव्यापी नहीं किया जाएगा।
इस प्रयोग के लिए अंडाणुओं के भीतर विभिन्न फोकल विमानों के बीच चलते हुए कई एमसीएमटीओसी एब्लेशन की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रयोग के समय को कम करने के लिए प्रयोग को निष्पादित करने से पहले इस तकनीक का कई बार अभ्यास करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, जिससे अंडाणु व्यवहार्यता बढ़ जाती है। इसके अलावा, न्यूनतम लेजर शक्ति का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो अंडाणु व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना एमसीएमटीओसी को कम करने के लिए पर्याप्त है।
इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, मल्टी-फोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप नियमित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक महंगे हैं। दूसरा, विभिन्न फोकल विमानों पर सभी एमसीएमटीओसी को परेशान करना रासायनिक या आनुवंशिक गड़बड़ी की तुलना में अधिक समय लेने वाला है। तीसरा, इस प्रोटोकॉल के लिए कम से कम समय में सभी MCMTOCs को समाप्त करने के लिए तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। हालांकि, एक बार महारत हासिल करने के बाद, मल्टी-फोटॉन लेजर का उपयोग माउस ओसाइट्स में कई इंट्रासेल्युलर संरचनाओं को परेशान करने के लिए एक उत्कृष्ट रणनीति प्रदान करता है, जिसमें एमसीएमटीओसी भी शामिल हैं, जो स्पिंडल पोजिशनिंग को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की समझ में योगदान देते हैं और स्तनधारी अंडाणुओं में इसके समय पर प्रवास करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक अपनी मूल्यवान सहायता और चर्चाओं के लिए बालबौला प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखकों ने एमचेरी-सीईपी 192 निर्माण को साझा करने के लिए मेलिना शुह को धन्यवाद दिया। इस अध्ययन को आर 35 जीएम 142537 (एनआईजीएमएस, एनआईएच) द्वारा एजेडबी के लिए समर्थित किया गया था।
4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
Medium Essential Medium Eagle – MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 – 1L | |
Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |