O-Ring Aort Bantlamasına Karşı Geleneksel Transvers Aort Daralması Basınç Aşırı Yüküne Bağlı Kardiyak Hipertrofinin Modellenmesi İçin
Summary
Mevcut protokol, basınç aşırı kardiyak hipertrofisini indüklemek için farelerde yeni bir aort bantlama tekniğini tanımlamaktadır. Bantlama için, sabit bir iç çapa sahip bir lastik halka kullanılır. Bu yeni teknik, gelecekteki deneyler için daha az varyans ve daha fazla tekrarlanabilir veri vaat ediyor.
Abstract
Farelerde aort bantlaması, kardiyak basıncın aşırı yüklenmesine bağlı kardiyak hipertrofi ve kalp yetmezliğinin indüksiyonu için en sık kullanılan deneysel modellerden biridir. Daha önce kullanılan teknik, darlık oluşturmak için körelmiş bir 27 G iğne üzerine bağlanmış aort kemerinin etrafındaki dişli bir dikişe dayanmaktadır. Bu yöntem, cerrahın ipliği manuel olarak sıkmasına bağlıdır ve bu nedenle çap boyutunda yüksek varyansa yol açar. Melleby ve ark. tarafından tanımlanan yeni rafine edilmiş bir yöntem, ameliyattan sonra daha az varyans ve daha fazla tekrarlanabilirlik vaat ediyor. Yeni teknik, o-ring-aort bantlama (ORAB), iplikli bir dikiş yerine kaymaz bir kauçuk halka kullanır, bu da aşırı basınç yükünde ve kardiyak hipertrofinin tekrarlanabilir fenotiplerinde azalmaya neden olur. Ameliyat sırasında, o-ring brakiyosefalik ve sol karotis arterler arasına yerleştirilir. Başarılı daralma ekokardiyografi ile doğrulanır. 1 gün sonra, halkanın doğru yerleştirilmesi, o-ring kaynaklı darlık üzerinde transvers aortta artan bir akış hızı ile sonuçlanır. 2 hafta sonra, bozulmuş kalp fonksiyonu, azalmış ejeksiyon fraksiyonu ve artmış duvar kalınlığı ile kanıtlanmıştır. Önemli olarak, çap boyutunda daha az varyans olmasının yanı sıra, ORAB transvers aort daralması (TAC) ile karşılaştırıldığında daha düşük intra- ve postoperatif mortalite oranları ile ilişkilidir. Bu nedenle, ORAB yaygın olarak kullanılan TAC cerrahisinden daha üstün bir yöntemi temsil eder, bu da daha tekrarlanabilir sonuçlara ve ihtiyaç duyulan hayvan sayısında olası bir azalmaya neden olur.
Introduction
Fizyolojik kardiyak hipertrofi gelişim, egzersiz ve gebelik sırasında gözlenebilirken, patolojik kardiyak hipertrofi arteriyel hipertansiyon, kapak kalp hastalığı veya gen mutasyonları gibi hemodinamik stres durumlarına yanıt verir. Başlangıçta, kalp, kardiyak fonksiyonu korumak için artmış kardiyomiyosit boyutu ve ventrikül duvarlarının kalınlaşması ile karakterize bir yeniden şekillenmeye uğrar 1,2. Öte yandan, patolojik kardiyak yeniden yapılanma, artmış aritmi, ani ölüm ve yüksek mortalite riski ile ilişkilidir. Son olarak, zamanla, ventriküler dilatasyon, kontraktil fonksiyonda güçlü bir azalma ve sonuçta yüksek morbidite, mortalite ve toplumsal maliyetlerle ilişkili olan kalp yetmezliğine (HF) progresyon ile sonuçlanır3. Bu nedenle, yeni terapötik stratejiler geliştirmek için moleküler arka planı anlamaya acil bir ihtiyaç vardır4.
Aort bandı, farelerde aşırı basınca bağlı sol ventrikül (LV) hipertrofisini ve kalp yetmezliğini taklit eden bir modeldir5. Bu yöntemle, aşırı basınca bağlı kardiyak yeniden şekillenmenin patomekanizmalarını in vivo olarak incelemek mümkündür. Farelerde ilk aort bantlama prosedürü Rockman ve ark.6 tarafından bildirilmiştir. Aşırı basınç yükü, aort çevresinde (brakiyosefalik ve sol ortak karotis arter arasında) iplik sütür bazlı bir ligasyon ile indüklenir. 0.4 mm çapında bir darlık oluşturmak için, 27 G’lik bir iğne ve aortun etrafına bir dikiş yerleştirilir. Ligasyondan sonra iğneçıkarılır 6,7.
İğne çapı sabit olmasına rağmen, ipliğin sıkılığı cerraha büyük ölçüde bağlıdır ve bu nedenle indüklenen kardiyak hipertrofi fenotipini etkiler. Ayrıca iplik/dikiş bazlı yöntemde ameliyat sonrası darlık çapı değişken derecelerde olup, mortalitede yüksek varyans 8,9 ile ilişkilidir. Dahası, bu yöntemin eğitimi, özellikle ipliğin sıkılmasında doğru seviyeyi ve tutarlılığı bulma konusunda zordur. Son olarak, eğitimin başlangıcında, aortun bozulması veya diğer doku hasarlarına bağlı yüksek intra ve postoperatif mortalitenin yanı sıra, hayatta kalan hayvanlarda darlık derecesinde yüksek varyasyon meydana gelir.
Son zamanlarda, Melleby ve ark.10 tarafından optimize edilmiş bir aort bantlama prosedürü tanımlanmıştır. Sabit iç çapı 0.71 mm, 0.66 mm ve 0.61 mm olan kaymaz kauçuk o-ring kullanılarak darlıkta daha az varyans ve yüksek oranda tekrarlanabilir basınç aşırı basınç seviyeleri ile ORAB (o-ring aort bantlama) yöntemini sundular. Kısacası, o-ring kesilir, yükselen kemerin etrafına yerleştirilir ve tekrar ipliklerle kapatılır. Bu o-ringleri kullanan diğer bilim adamları, indüklenen kardiyak hipertrofi9’da daha az değişkenlik bildirmişlerdir. Ayrıca intraoperatif ve postoperatif mortalitenin yanı sıra indüklenen hipertrofik fenotip 9,11’de daha iyi tekrarlanabilirlik ve daha az varyans gözlendi. Bu makalede, adım adım bir protokolde bu benzersiz stratejinin yordamı açıklanmaktadır. Bu raporda paylaşılan uzmanlık, diğer bilim adamlarının bu alandaki tekniklerini geliştirmelerine yardımcı olacaktır.
6 hafta sonra kalp yetmezliği ile sonuçlanan kardiyak hipertrofisi indüklemek için, 12 haftalık C57BL / 6N erkek fareler ameliyat için önerilmektedir. Fare alt suşları C57BL/6N ve C57BL/6J arasındaki aort bandından 2 hafta sonra yapılan karşılaştırmada C57BL/6N farelerde ciddi kardiyak disfonksiyon ve buna bağlı artmış mortalite görüldü. Bu nedenle, bunlar kalp yetmezliği modelleri için daha uygundur12. On iki haftalık erkek ve dişi fareler, aortun maruz kalması ve o-ringin özel aletlerle yerleştirilmesi için en uygun boyuta sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İplik/sütür bazlı aort bandı, farelerde aşırı basınç-aşırı kardiyak hipertrofisi indüklemek için uzun yıllardır kullanılmaktadır. Kardiyak remodeling ve hastalığın progresyonunun patomekanizmalarını in vivo olarak araştırmak için kurulmuş bir yöntemdir. Sınırlamalar, darlık derecesindeki nispeten yüksek varyans ve sonuç olarak yeniden şekillenmedir. İlk olarak Melleby ve ark.10 tarafından tanımlanan yakın zamanda tanıtılan ORAB tekniği, kauçuk b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) tarafından L.L., N.F. ve O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
References
- Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: The good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
- Bui, A. L., Horwich, T. B., Fonarow, G. C. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 30-41 (2011).
- Bolli, R. New initiatives to improve the rigor and reproducibility of articles published in Circulation Research. Circulation Research. 121 (5), 472-479 (2017).
- Dunlay, S. M., Weston, S. A., Jacobsen, S. J., Roger, V. L. Risk factors for heart failure: A population-based case-control study. The American Journal of Medicine. 122 (11), 1023-1028 (2009).
- Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Circulation Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Mohammed, S. F., et al. Variable phenotype in murine transverse aortic constriction. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 188-198 (2012).
- Nakao, Y., et al. O-ring-induced transverse aortic constriction (OTAC) is a new simple method to develop cardiac hypertrophy and heart failure in mice. Scientific Reports. 12, 85 (2022).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Lindsey, M. L., Kassiri, Z., Virag, J. A. I., de Castro Bras, L. E., Scherrer-Crosbie, M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 733-752 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (38), e1729 (2010).
