O-ring aortabanding versus traditionele transversale aortavernauwing voor het modelleren van drukoverbelasting-geïnduceerde cardiale hypertrofie
Summary
Het huidige protocol beschrijft een nieuwe techniek van aortabanding bij muizen om drukoverbelasting cardiale hypertrofie te induceren. Voor het banderen wordt een rubberen ring met een vaste binnendiameter gebruikt. Deze nieuwe techniek belooft minder variantie en meer reproduceerbare gegevens voor toekomstige experimenten.
Abstract
Aortabanding bij muizen is een van de meest gebruikte experimentele modellen voor cardiale drukoverbelasting-geïnduceerde cardiale hypertrofie en de inductie van hartfalen. De eerder gebruikte techniek is gebaseerd op een schroefdraadverbinding rond de aortaboog die over een stompe naald van 27 G is gebonden om stenose te creëren. Deze methode is afhankelijk van de chirurg die de draad handmatig aanspant en leidt dus tot een hoge variantie in de diametergrootte. Een nieuw verfijnde methode beschreven door Melleby et al. belooft minder variantie en meer reproduceerbaarheid na de operatie. De nieuwe techniek, o-ring- aortabanding (ORAB), maakt gebruik van een antislip rubberen ring in plaats van een hechtdraad, wat resulteert in verminderde variatie in drukoverbelasting en reproduceerbare fenotypen van cardiale hypertrofie. Tijdens de operatie wordt de o-ring geplaatst tussen de brachiocephalische en linker halsslagaders. Succesvolle vernauwing wordt bevestigd door echocardiografie. Na 1 dag resulteert de juiste plaatsing van de ring in een verhoogde stroomsnelheid in de transversale aorta over de o-ring-geïnduceerde stenose. Na 2 weken wordt een verminderde hartfunctie bewezen door een verminderde ejectiefractie en een verhoogde wanddikte. Belangrijk is dat, naast minder variatie in de diametergrootte, ORAB geassocieerd is met lagere intra- en postoperatieve sterftecijfers in vergelijking met transversale aortavernauwing (TAC). ORAB vertegenwoordigt dus een superieure methode voor de veelgebruikte TAC-chirurgie, wat resulteert in meer reproduceerbare resultaten en een mogelijke vermindering van het aantal benodigde dieren.
Introduction
Terwijl fysiologische cardiale hypertrofie kan worden waargenomen tijdens ontwikkeling, lichaamsbeweging en zwangerschap, reageert pathologische cardiale hypertrofie op hemodynamische stressaandoeningen zoals arteriële hypertensie, hartklepaandoeningen of genmutaties. Aanvankelijk ondergaat het hart een remodellering die wordt gekenmerkt door een verhoogde cardiomyocytengrootte en verdikking van de ventriculaire wanden om de hartfunctie te behouden 1,2. Aan de andere kant wordt pathologische cardiale remodellering geassocieerd met een verhoogd risico op aritmie, plotselinge dood en hoge mortaliteit. Ten slotte resulteert het na verloop van tijd in ventriculaire verwijding, een sterke afname van de contractiele functie en uiteindelijke progressie naar hartfalen (HF), wat geassocieerd is met hoge morbiditeit, mortaliteit en maatschappelijke kosten3. Daarom is er een dringende behoefte om de moleculaire achtergrond te begrijpen om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen4.
Aortabanding is een model dat drukoverbelasting-geïnduceerde linkerventrikel (LV) hypertrofie en hartfalen bij muizen5 nabootst. Met deze methode is het mogelijk om de pathhomemechanismen van door drukoverbelasting geïnduceerde cardiale remodellering in vivo te onderzoeken. De eerste aortabandingsprocedure bij muizen werd gemeld door Rockman et al.6. Drukoverbelasting wordt geïnduceerd door een op draadverbinding gebaseerde ligatie rond de aorta (tussen de brachiocephalische en linker gemeenschappelijke halsslagader). Om een stenose met een diameter van 0,4 mm te creëren, wordt een hechtdraad rond een naald van 27 G en de aorta geplaatst. Na ligatie wordt de naald verwijderd 6,7.
Hoewel de naalddiameter vast is, is de strakheid van de draad sterk afhankelijk van de chirurg en beïnvloedt daarom het geïnduceerde fenotype van cardiale hypertrofie. Bovendien is er in de op draad/hechtingen gebaseerde methode een variabele mate van stenosediameter na de operatie, geassocieerd met een hoge variantie in mortaliteit 8,9. Bovendien is het trainen van deze methode een uitdaging, vooral met betrekking tot het vinden van het juiste niveau en consistentie in het aanspannen van de draad. Ten slotte treedt aan het begin van de training een hoge intra- en postoperatieve mortaliteit op als gevolg van verstoring van de aorta of ander weefselletsel, evenals een hoge variatie in de mate van stenose bij de overlevende dieren.
Onlangs werd een geoptimaliseerde procedure van aortabanding beschreven door Melleby et al.10. Ze presenteerden de ORAB-methode (o-ring aortabanding) met minder variatie in stenose en zeer reproduceerbare niveaus van drukoverbelasting door gebruik te maken van een antislip rubberen o-ring met een vaste binnendiameter van 0,71 mm, 0,66 mm en 0,61 mm. Kortom, de o-ring wordt opengesneden, rond de opgaande boog geplaatst en weer gesloten door draden. Andere wetenschappers die deze o-ringen gebruikten, rapporteerden minder variabiliteit in de geïnduceerde cardiale hypertrofie9. Ze observeerden ook intra- en postoperatieve mortaliteit, evenals een betere reproduceerbaarheid en minder variantie in het geïnduceerde hypertrofische fenotype 9,11. Dit artikel beschrijft de procedure van deze unieke strategie in een stap-voor-stap protocol. De expertise die in dit rapport wordt gedeeld, zal andere wetenschappers helpen hun technieken op dit gebied te verbeteren.
Om cardiale hypertrofie te induceren die resulteert in hartfalen na 6 weken, worden 12 weken oude C57BL / 6N mannelijke muizen aanbevolen voor een operatie. Een vergelijking 2 weken na aortabanding tussen de muissubstrains C57BL/6N en C57BL/6J toonde ernstige cardiale disfunctie en geassocieerde verhoogde mortaliteit bij C57BL/6N muizen. Daarom zijn deze beter geschikt voor modellen van hartfalen12. Twaalf weken oude mannelijke en vrouwelijke muizen hebben een optimale grootte voor blootstelling van de aorta en plaatsing van de o-ring met speciale instrumenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Op schroefdraad/hechting gebaseerde aortabanding wordt al vele jaren gebruikt om cardiale hypertrofie met drukoverbelasting bij muizen te induceren. Het is een gevestigde methode om de pathomechanismen van cardiale remodellering en ziekteprogressie in vivo te onderzoeken. De beperkingen zijn de relatief hoge variantie in de mate van stenose en bijgevolg de verbouwing. De onlangs geïntroduceerde ORAB-techniek die voor het eerst werd beschreven door Melleby et al.10 optimaliseert de conve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) aan L.L., N.F., en O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
Materials
| 1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
| 2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
| 2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
| 2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
| 3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
| 3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
| 4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
| 6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
| 8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
| Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
| C57BL/6N mice | Charles River | ||
| Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
| Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
| Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
| i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
| isofluran | Baxter | Anesthesia | |
| Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
| ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
| Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
| Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
| MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
| Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
| Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
| O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
| Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
| Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
| Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
| Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
| three-way stop cock (blue) | |||
| Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
| transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
| vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |
References
- Frey, N., Olson, E. N. Cardiac hypertrophy: The good, the bad, and the ugly. Annual Review of Physiology. 65, 45-79 (2003).
- Bui, A. L., Horwich, T. B., Fonarow, G. C. Epidemiology and risk profile of heart failure. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 30-41 (2011).
- Bolli, R. New initiatives to improve the rigor and reproducibility of articles published in Circulation Research. Circulation Research. 121 (5), 472-479 (2017).
- Dunlay, S. M., Weston, S. A., Jacobsen, S. J., Roger, V. L. Risk factors for heart failure: A population-based case-control study. The American Journal of Medicine. 122 (11), 1023-1028 (2009).
- Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Circulation Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Hu, P., et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Mohammed, S. F., et al. Variable phenotype in murine transverse aortic constriction. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 188-198 (2012).
- Nakao, Y., et al. O-ring-induced transverse aortic constriction (OTAC) is a new simple method to develop cardiac hypertrophy and heart failure in mice. Scientific Reports. 12, 85 (2022).
- Melleby, A. O., et al. A novel method for high precision aortic constriction that allows for generation of specific cardiac phenotypes in mice. Cardiovascular Research. 114 (12), 1680-1690 (2018).
- Lindsey, M. L., Kassiri, Z., Virag, J. A. I., de Castro Bras, L. E., Scherrer-Crosbie, M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 733-752 (2018).
- Garcia-Menendez, L., Karamanlidis, G., Kolwicz, S., Tian, R. Substrain specific response to cardiac pressure overload in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (3), 397-402 (2013).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (38), e1729 (2010).
