Denne protokollen beskriver en ny teknikk for aortabånd hos mus for å indusere trykkoverbelastning hjertehypertrofi. For bånd brukes en gummiring med fast indre diameter. Denne nye teknikken lover mindre varians og mer reproduserbare data for fremtidige eksperimenter.
Aortabånd hos mus er en av de mest brukte eksperimentelle modellene for hjertetrykksoverbelastningsindusert hjertehypertrofi og induksjon av hjertesvikt. Den tidligere brukte teknikken er basert på en gjenget sutur rundt aortabuen bundet over en avstumpet 27 G nål for å skape stenose. Denne metoden avhenger av at kirurgen strammer tråden manuelt og fører dermed til høy varians i diameterstørrelsen. En nylig raffinert metode beskrevet av Melleby og medarbeidere lover mindre varians og mer reproduserbarhet etter operasjonen. Den nye teknikken, o-ring-aortabånd (ORAB), bruker en sklisikker gummiring i stedet for en sutur med en tråd, noe som resulterer i redusert variasjon i trykkoverbelastning og reproduserbare fenotyper av hjertehypertrofi. Under operasjonen plasseres o-ringen mellom brakiocephalic og venstre karoten arterier. Vellykket innsnevring er bekreftet ved ekkokardiografi. Etter 1 dag resulterer korrekt plassering av ringen i økt strømningshastighet i transversal aorta over o-ringindusert stenose. Etter 2 uker påvises nedsatt hjertefunksjon ved redusert ejeksjonsfraksjon og økt veggtykkelse. I tillegg til mindre variasjon i diameterstørrelsen, er ORAB assosiert med lavere intra- og postoperativ mortalitet sammenlignet med transversal aorta-innsnevring (TAC). ORAB representerer således en overlegen metode i forhold til den vanlige TAC-operasjonen, noe som resulterer i mer reproduserbare resultater og en mulig reduksjon i antall dyr som trengs.
Mens fysiologisk hjertehypertrofi kan observeres under utvikling, trening og graviditet, reagerer patologisk hjertehypertrofi på hemodynamiske stressforhold som arteriell hypertensjon, hjerteklaffsykdom eller genmutasjoner. I utgangspunktet gjennomgår hjertet en ombygging preget av økt kardiomyocyttstørrelse og fortykning av ventrikulære vegger for å opprettholde hjertefunksjon 1,2. På den annen side er patologisk hjerteombygging forbundet med økt risiko for arytmi, plutselig død og høy dødelighet. Til slutt, med tiden, resulterer det i ventrikulær utvidelse, en sterk reduksjon i kontraktil funksjon og eventuell progresjon til hjertesvikt (HF), som er forbundet med høy sykelighet, dødelighet og samfunnskostnader3. Derfor er det et presserende behov for å forstå den molekylære bakgrunnen for å utvikle nye terapeutiske strategier4.
Aortabånd er en modell som etterligner trykkoverbelastningsindusert venstre ventrikulær (LV) hypertrofi og hjertesvikt hos mus5. Med denne metoden er det mulig å undersøke patomekanismene for trykkoverbelastningsindusert hjerteoppussing in vivo. Den første aortabåndprosedyren hos mus ble rapportert av Rockman et al.6. Trykkoverbelastning induseres av en trådsuturbasert ligering rundt aorta (mellom brakiocephalic og venstre vanlig halspulsåre). For å skape en stenose med en diameter på 0,4 mm, plasseres en sutur rundt en 27 G nål og aorta. Etter ligering fjernes nålen 6,7.
Selv om nåldiameteren er fast, er trådens tetthet svært avhengig av kirurgen og påvirker derfor den induserte fenotypen av hjertehypertrofi. I tillegg er det i den tråd-/suturbaserte metoden en variabel grad av stenosediameter etter operasjon, assosiert med høy varians i mortalitet 8,9. Videre er opplæring av denne metoden utfordrende, spesielt med tanke på å finne riktig nivå og konsistens i å stramme tråden. Til slutt, i begynnelsen av treningen, oppstår høy intra- og postoperativ dødelighet på grunn av forstyrrelse av aorta eller annen vevsskade, samt høy variasjon i omfanget av stenose hos de overlevende dyrene.
Nylig ble en optimalisert prosedyre for aortabånd beskrevet av Melleby et al.10. De presenterte ORAB -metoden (o-ring aorta banding) med mindre varians i stenose og svært reproduserbare nivåer av trykkoverbelastning ved å bruke en sklisikker gummi o-ring med en fast indre diameter på 0,71 mm, 0,66 mm og 0,61 mm. Kort sagt, o-ringen er kuttet åpen, plassert rundt den stigende buen og lukket igjen av tråder. Andre forskere som brukte disse o-ringene rapporterte mindre variasjon i indusert hjertehypertrofi9. De observerte også intra- og postoperativ mortalitet, samt bedre reproduserbarhet og mindre varians i indusert hypertrofisk fenotype 9,11. Denne artikkelen beskriver prosedyren for denne unike strategien i en trinnvis protokoll. Kompetansen som deles i denne rapporten vil hjelpe andre forskere til å forbedre sine teknikker på dette området.
For å indusere hjertehypertrofi som resulterer i hjertesvikt etter 6 uker, anbefales 12 uker gamle C57BL/6N hannmus for kirurgi. En sammenligning 2 uker etter aortabånd mellom musestammene C57BL/6N og C57BL/6J viste alvorlig hjertedysfunksjon og assosiert økt dødelighet hos C57BL/6N mus. Derfor er disse bedre egnet for modeller av hjertesvikt12. Tolv uker gamle hann- og hunnmus har en optimal størrelse for eksponering av aorta og plassering av o-ringen med spesielle instrumenter.
Tråd / suturbasert aortabånd har blitt brukt i mange år for å indusere trykkoverbelastning hjertehypertrofi hos mus. Det er en etablert metode for å undersøke patomekanismene for hjerteremodellering og sykdomsprogresjon in vivo. Begrensningene er den relativt høye variansen i graden av stenose og følgelig ombyggingen. Den nylig introduserte ORAB-teknikken først beskrevet av Melleby et al.10 optimaliserer den konvensjonelle metoden ved å bruke en gummi-o-ring.
<p class="jove…The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) til L.L., N.F., og O.J.M. (IVOLADMT-HF; FKZ 01KC2006A).
1 x long Fixators, 6 cm | 18200-01 | ||
2 x Blunt Retractors, 5 mm wide | 18200-11 | ||
2 x Short Fixators, 3 cm | 18200-02 | ||
2 x fine tip 45° angled forceps | FST (fine sience tools) | 11160-10 | |
3 x Blunt Retractors, 2.5 mm wide | 18200-10 | ||
3 x Retractor Wires | 18200-05 | ||
4-0 absorbable suture (Vicryl) | ETHICON | SABBKLT0 | Used to suture skin |
6-0 suture (Prolene), needle size:13 mm | ETHICON | JDP879 | Used to suture chest muscle |
8-0 suture (Prolene), needle size: 6.5 mm | ETHICON | RHBECH | Used to fast the Ring |
Anesthetizing Box, Small | Havard apparatus | 50-0108 | |
C57BL/6N mice | Charles River | ||
Fluosorber Activated Charcoal Filter Canister | Havard apparatus | 34-0415 | Used to induce and maintain anesthesia |
Handmade laryngsopcope | Intubationshelp | ||
Harvard Apparatus Anesthetic Vaporizer | Havard apparatus | Used to induce and maintain anesthesia | |
Heating pad + rectal probe (LSI Letica Scientific Instruments:Temperature control unit HB 101/2 ) | Panlab/ Havard apparatus | Used to control and maintain body temperature | |
i.v. cannula blue 22-gauge (Vasofix Braunüle 0.9 x 25 mm) | B/Braunsharing Expertise | 4268091B | intubation |
isofluran | Baxter | Anesthesia | |
Kodan (betadine solution) | Schülke | 20003960-A | Desinfection |
ligation aid | FST (fine sience tools) | 18062-12 | Used to perform liagtion with O-ring |
Microscope Lighting: Schott VisiLED Set MC1500/S80-55 (+ controller) | SCHOTT | Ligth | |
Microscope camera (Leica IC80 HD) | Leica | Used for visualiation operating field | |
MiniVac Complete Anesthesia Systems for small rodents | Havard apparatus | 75-0233 | Used to induce and maintain anesthesia |
Mouse Ventilator MiniVent Type 845 | Havard Apparatus | 73-0044 | Used to ventilation during surgery |
Needle holder | FST (fine sience tools) | TE-10804 | |
O-ring, non-slip rubber (0.0018 mm x 0.020 mm) | Apple Rubber Products | Liagtion of the aortic arch | |
Scissors | FST (fine sience tools) | 14040-09 | Used to cut the skin and threads |
Small Animal Retraction System (Kit for Animals up to 200 g) | FST (fine sience tools) | 18200-20 | |
Small Base Plate, 20 x 30 cm | 18200-03 | ||
Table intgerated with heating pad + rectal probe + ECG and transducer tripod | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
Temgesic (Buprenorphin) | Indivior UK Limited | 997.00.00 | Pain pre-medication |
three-way stop cock (blue) | |||
Tramal (Tamadol) | Grünental | Pain post-medication | |
transducer probe MS400 (Visual Sonics) | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
Ultrasound system with cardioligy package | FujiFilm Visual Sonics Imaging System | Echocardiography | |
Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST (fine sience tools) | 15000-08 | Used to cut intercostal chest muscle |
vet ointment | Bepanten | Used to prevent eyes from drying out |