מיקרו-הנדסה הידרוג'ל קולגן תלת-ממדית עם יישור סיבים לטווח ארוך
Summary
פרוטוקול זה מדגים את השימוש בתעלה מיקרופלואידית עם שינוי גיאומטריה לאורך כיוון זרימת הנוזל כדי ליצור מאמץ מאריך (מתיחה) ליישור סיבים בהידרוג’ל קולגן תלת-ממדי (עובי <250 מיקרומטר). היישור המתקבל משתרע על פני מספר מילימטרים ומושפע מקצב המאמץ המתארך.
Abstract
סיבי קולגן I מיושרים (COL1) מנחים את תנועתיות תאי הגידול, משפיעים על המורפולוגיה של תאי האנדותל, שולטים בהתמיינות תאי גזע והם סימן ההיכר של רקמות הלב והשרירים-שלד. כדי לחקור את תגובת התאים למיקרו-סביבות מיושרות במבחנה, פותחו מספר פרוטוקולים ליצירת מטריצות COL1 עם יישור סיבים מוגדר, כולל שיטות מגנטיות, מכניות, מבוססות תאים ומיקרופלואידיות. מבין אלה, גישות מיקרופלואידיות מציעות יכולות מתקדמות כגון שליטה מדויקת על זרימת הנוזלים והמיקרו-סביבה התאית. עם זאת, הגישות המיקרופלואידיות ליצירת מטריצות COL1 מיושרות עבור פלטפורמות מתקדמות של תרביות חוץ גופיות הוגבלו ל”מחצלות” דקות (<40 מיקרומטר עובי) של סיבי COL1 המשתרעים על פני מרחקים של פחות מ-500 מיקרומטר ואינם תורמים ליישומי תרביות תאים תלת-ממדיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מטריצות 3D COL1 (130-250 מיקרומטר עובי) עם אזורים בקנה מידה מילימטרי של יישור סיבים מוגדר במכשיר מיקרופלואידי. פלטפורמה זו מספקת יכולות מתקדמות של תרביות תאים למדל מיקרו-סביבות רקמה מובנות על ידי מתן גישה ישירה למטריצה המהונדסת במיקרו עבור תרביות תאים.
Introduction
התאים שוכנים ברשת סיבית תלת-ממדית מורכבת הנקראת מטריצה חוץ-תאית (ECM), שרובה מורכב מסוג קולגן חלבוני מבני I (COL1)1,2. התכונות הביופיזיקליות של ECM מספקות רמזי הנחיה לתאים, ובתגובה, תאים מעצבים מחדש את מיקרו-ארכיטקטורה ECM 3,4,5. אינטראקציות הדדיות אלה בין תאים למטריצות יכולות ליצור תחומי סיבים מיושרים של COL16 המקדמים אנגיוגנזה ופלישת תאים בסביבת הגידול 7,8,9 ומשפיעים על מורפולוגיה של התא 10,11,12, קיטוב 13 והתמיינות 14. סיבי קולגן מיושרים גם מקדמים ריפוי פצעים 15, ממלאים תפקיד מפתח בהתפתחות רקמות16 ותורמים לתקשורת תאים ארוכת טווח17,18. לכן, שכפול המיקרו-ארכיטקטורה המקורית של סיבי COL1 במבחנה הוא צעד חשוב לקראת פיתוח מודלים מובנים לחקר תגובות תאים למיקרו-סביבות מיושרות.
מערכות תרבית תאים מיקרופלואידיות הוקמו כטכנולוגיה מועדפת לפיתוח מערכות מיקרופיזיולוגיות (MPS)19,20,21,22,23. תוך מינוף השפעות חיוביות של קנה מידה מיקרומטרי, מערכות אלה מספקות שליטה מדויקת על זרימת נוזלים, תומכות בהחדרה מבוקרת של כוחות מכניים ומגדירות את המיקרו-סביבה הביוכימית בתוך מיקרו-ערוץ 21,24,25,26,27. פלטפורמות MPS שימשו למדל מיקרו-סביבות ספציפיות לרקמות ולחקור אינטראקציות מרובות איברים28. במקביל, הידרוג’לים נחקרו באופן נרחב כדי לשחזר את המכניקה התלת-ממדית וההשפעה הביולוגית של ECM שנצפו in vivo29,30. עם דגש הולך וגובר על שילוב תרבית תלת ממדית עם פלטפורמות מיקרופלואידיות, גישות רבות יכולות לשלב הידרוג’ל COL1 בהתקנים מיקרופלואידים31,32,33. עם זאת, השיטות ליישור הידרוג’לים COL1 בתעלות מיקרופלואידיות הוגבלו ל”מחצלות” דו-ממדיות דקות (<40 מיקרומטר עובי) בתעלות ברוחב <1 מ"מ), המציעות פוטנציאל מוגבל למדל תגובות תאים במיקרו-סביבות תלת-ממדיות מיושרות31,34,35,36.
כדי להשיג הידרוג’לים תלת-ממדיים COL1 מיושרים במערכת מיקרופלואידית, הוכח כי כאשר תמיסת COL1 בהרכבה עצמית נחשפת לזרימות הארכה מקומיות (שינוי מהירות לאורך כיוון הנחל), ההידרוג’לים COL1 המתקבלים מציגים מידה של יישור סיבים ביחס ישר לגודל קצב המאמץ המתרחב שהם חווים37, 38. עיצוב המיקרו-ערוצים בפרוטוקול זה ייחודי בשתי דרכים; ראשית, העיצוב המקוטע מציג מתח הארכה מקומי לפתרון COL1, ושנית, המבנה “של שני חלקים” מאפשר למשתמש ליישר סיבי COL1 ולאחר מכן לפרק את התעלה כדי לגשת ישירות לסיבים המיושרים בפורמט פתוח. גישה זו יכולה להיות מאומצת גם לפיתוח פלטפורמות מיקרופלואידיות מודולריות המפתחות מערכות מיקרופיזיולוגיות עם מטריצות COL1 מסודרות. הפרוטוקול הבא מתאר את תהליך ייצור מיקרו-ערוצים מפולחים ומפרט את השימוש בתעלות ליישור אטלו בקר COL1. פרוטוקול זה מספק גם הוראות לגידול תאים ב- COL1 בפורמט באר פתוחה ודן בהוספת פונקציונליות לפלטפורמה באמצעות שכבת בסיס מגנטית מודולרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקולים ליצירת מטריצות COL1 עם סיבים מיושרים תוארו באמצעות שיטות מגנטיות, יישום ישיר של מתח מכני, וטכניקות מיקרופלואידיות47. גישות מיקרופלואידיות משמשות בדרך כלל ליצירת מערכות מיקרופיזיולוגיות בגלל מאפייני הזרימה וההובלה המוגדרים היטב שלהן, המאפשרים שליטה מדויקת על המיקר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר R21GM143658 ועל ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר 2150798. התוכן הוא באחריות הכותבים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של הגופים המממנים.
Materials
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
| 20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
| 3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
| 3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
| ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
| BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
| Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
| Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
| Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
| Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
| Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
| Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
| Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
| Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
| Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
| PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
| Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
| Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
| Silicon wafer | University wafer | 452 | |
| Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
| Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
References
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
- Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
- Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
- Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
- Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
- Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
- Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
- Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
- Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
- Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
- Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
- Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
- Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
- Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
- Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
- Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
- Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
- Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
- Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
- Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
- Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
- Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
- Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
- Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
- Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
- Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
- Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
- Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
- Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).
