Skjærbehandling under hydrogeldannelse resulterer i produksjon av mikrogelsuspensjoner som skjærer tynne, men raskt omstruktureres etter fjerning av skjærkrefter. Slike materialer har blitt brukt som en støttematrise for bioprinting komplekse, cellebelastede strukturer. Her beskrives metoder for fremstilling av støtteseng og kompatible bioblekk.
Bruken av granulære matriser for å støtte deler under bioprintingsprosessen ble først rapportert av Bhattacharjee et al. i 2015, og siden da har flere tilnærminger blitt utviklet for fremstilling og bruk av støttende gelsenger i 3D-bioprinting. Dette papiret beskriver en prosess for å produsere mikrogelsuspensjoner ved bruk av agarose (kjent som flytende geler), hvor partikkeldannelse styres av påføring av skjær under gelering. Slik prosessering produserer nøye definerte mikrostrukturer, med påfølgende materialegenskaper som gir klare fordeler som innebygging av trykte medier, både kjemisk og mekanisk. Disse inkluderer å oppføre seg som viskoelastiske faste materialer ved null skjær, begrense langdistansediffusjon, og demonstrere den karakteristiske skjærtynnende oppførselen til flokkulerte systemer.
Ved fjerning av skjærspenning har væskegeler imidlertid kapasitet til raskt å gjenopprette sine elastiske egenskaper. Denne mangelen på hysterese er direkte knyttet til de definerte mikrostrukturene som tidligere ble hentydet til; På grunn av behandlingen letter reaktive, ikke-gelerte polymerkjeder ved partikkelgrensesnittet interpartikkelinteraksjoner – som ligner på en borrelåseffekt. Denne raske gjenopprettingen av elastiske egenskaper gjør det mulig å trykke høyoppløselige deler fra biomaterialer med lav viskositet, da rask reformering av støttesengen fanger bioblekket in situ og opprettholder formen. Videre er en fordel med agarosevæskegeler de asymmetriske gelerings- / smelteovergangene (geleringstemperatur på ~ 30 ° C og smeltetemperatur på ~ 90 ° C). Denne termiske hysteresen av agarose gjør det mulig å trykke og dyrke den bioprintede delen in situ uten at støttevæskegelen smelter. Denne protokollen viser hvordan man produserer agarosevæskegeler og demonstrerer deres bruk for å støtte produksjonen av en rekke komplekse hydrogeldeler innen suspended-layer additiv produksjon (SLAM).
Hydrogeler er perfekte materialer å bruke som støtter for cellevekst1. Avhengig av materialet som brukes, gel de via milde mekanismer som ikke kompromitterer cellens levedyktighet 2,3. Det høye vanninnholdet (typisk >90%) betyr at næringsstoffer og oksygen lett kan diffundere inn i materialet og avfallsprodukter fra cellemetabolisme diffunderer ut4. Som sådan har celle levedyktighet vist seg å bli bevart i perioder over 1 år5, og det er nå eksempler på hydrogeler som brukes til å lagre eller “pause” celler for fremtidig terapeutisk bruk6. De har blitt mye brukt i vevsteknikk for produksjon av vevlignende strukturer, men deres bruk har en tendens til å være begrenset av vanskeligheten med å kontrollere både strukturen og sammensetningen av materialet. Historisk sett er hydrogelstyrken relativt lav (i forhold til mange harde vev), på grunn av det høye vanninnholdet og lave volumer okkupert av polymermatrisen som danner strukturen. Videre tilbyr mange veier til gelering (termisk, ionotrop, fibrillogenese) rimelig langsom kinetikk, noe som betyr at deres mekaniske egenskaper har en tendens til å utvikle seg jevnt med tiden. Med unntak av interpenetrerende nettverk, resulterer lav mekanisk stivhet og langsomme herdetider ofte i bioblekk som ikke klarer å stå fritt ved avsetning, og har en tendens til å “synke” og miste definisjonen når de først ekstruderes.
I et forsøk på å overvinne dette nøkkelproblemet er det utviklet innebygde utskriftsteknikker som gir støtte under utskrift, mens de mekaniske egenskapene til konstruksjonen utvikler 7,8. Når mikrostrukturen til gelen er fullt utviklet og de mekaniske egenskapene når et optimalt, kan støttematrisen fjernes, vanligvis gjennom skånsom vask eller smelting av støttefasen. Innledende arbeid med denne tilnærmingen benyttet en viskøs pluronisk dispersjon der sekundærfasen ble fordelt9. Mer nylig brukte Bhattacharjee et al. geler i form av granulert karbopol for å demonstrere at cellepaneler kunne suspenderes i støttegelen10. Deretter rapporterte Hinton et al. om ekstrudering av gelbaserte materialer som inneholder celler i en støtteseng som besto av en mikrogelsuspensjon dannet av granulær gelatin11. Etter ekstrudering av den celleholdige hydrogelen og dens påfølgende herding, ble gelatinen fjernet ved forsiktig oppvarming av støttebadet, noe som muliggjorde smelting av gelatinen. Dessverre presenterer denne prosessen fortsatt flere begrensninger. For eksempel er den kjemiske strukturen av gelatin i forhold til kollagen (følgelig til at det er en hydrolysert form for kollagen) slik at mange kjemiske deler over ryggraden kan samhandle med biologiske enheter; Dermed kan en gjenværende støttematrise forstyrre nedstrøms biologiske prosesser. Videre utgjør animalske avledede produkter restriktiv bruk når man ser mot oversettbarheten av en teknologi. Dette skaper utfordringer hvis den produserte delen er ment å brukes klinisk, eller selv om den skal brukes til å svare på grunnleggende biologiske spørsmål, der denne overflateforurensningen kan forårsake et betydelig problem.
Vi har senere opprettet en raffinert prosess som muliggjør suspendert produksjon av hydrogeler, innenfor en støttende matrise, som ikke har noen kostnad under fysiologiske forhold og er dannet av ikke-animalske materialer. Selv om prosessen kan brukes med en rekke biopolymere støtter, gir agarose et materiale som er inert mot biologiske interaksjoner, da det er sukkerbasert og nøytralt ladet ved fysiologisk pH12,13. I stedet for å fragmentere en allerede eksisterende gel, dannes støttematerialet ved påføring av skjær under gelering14,15,16. Dette produserer en matrise av partikler som viser dendronlignende egenskaper på overflaten og dispergeres i en sekundær matrise av ungelled polymer17,18. Resultatet er et materiale med interessante materialegenskaper 19,20,21,22 som kan skjærtynne på samme måte som tidligere rapporterte granulære geler, men har en tendens til å gjenvinne viskositeten raskere når skjæret fjernes 23. Når det cellebærende materialet ekstrudert inn i støttematrisen er fullstendig modnet, kan støttematrisen fjernes gjennom forsiktig omrøring før den plasseres i kultur. Det har vist seg at det er mulig å bruke denne prosessen til å produsere materialer med komplekse strukturer og rekapitulere de biologiske strukturer av både hud og osteokondral regionen23,24,25. Dette metodepapiret beskriver i detalj hvordan man produserer støttematerialet og fremhever passende bioblekk som brukes i en rekke komplekse strukturer.
Vurdering av valg av materialer som brukes til støttesengen
Under utviklingsstadiet var det forskjellige egenskaper som kreves av støttesengen. Disse egenskapene inkluderte: i) opprettholde tilstrekkelig struktur for å suspendere det ekstruderte materialet; ii) skjærtynningskapasitet slik at skrivehodet kan bevege seg fritt gjennom støttematerialet; iii) rask restrukturering (selvhelbredende egenskaper), som danner støtte rundt det deponerte bioblekket; iv) termisk stabil ved både romtemperatur og fysiologiske temperaturer; v) nøytralt (dvs. uladet) materiale som er relativt bioinert, over en rekke pH og elektrolytter (ioniske arter og konsentrasjoner), som forhindrer interaksjoner med celler og ladede bioblekk; vi) ikke-giftig; og, vii) fortrinnsvis fra en ikke-animalsk kilde.
Selv om det er mange biopolymermaterialer som opprettholder flere av disse iboende egenskapene, med kapasitet til å utføre suspendert 3D-additiv produksjon uten å overholde alle disse egenskapene 11,26,27, var intensjonen her å produsere en støtteseng som ville overvinne visse praktiske problemer knyttet til andre støttematerialer. På grunn av de kjemiske egenskapene til agarose, og spesielt når de formuleres som en partikkelformig væskegel, kan alle disse egenskapene oppnås. Dette muliggjorde en støtteseng som kunne brukes over et bredt utvalg av bioblekk23,24,25,28. Faktisk ga materialets bioinerte natur potensialet til å opprettholde den trykte strukturen in situ gjennom hele kulturen, slik at tilstrekkelige tidsskalaer for mange forskjellige bioblekk kunne utvikles fullt ut, uten endringer i biologien. Videre tillot den partikkelformede, tynnende naturen enkel fjerning fra den endelige trykte konstruksjonen, mens den giftfrie, ikke-animalske opprinnelsen tillater potensialet for rask oversettelse mot klinikken, overvinne barrierer knyttet til etiske og regulatoriske krav.
Hensyn i valg av materialer til bioblekkene
I bioprinting med direkte ekstrudering avsettes bioblekk på en 2D-printseng. Det er fordelaktig at monomer bioblekkløsninger har skjærtynnende oppførsel; For å produsere hi-fi-konstruksjoner med fysiologisk relevante dimensjoner må de imidlertid ha lav tiksotropi og gjenopprette til tilstrekkelig høye viskositeter slik at de danner faste filamenter ved avsetning 29,30,31. Med økt viskositet er trykket som kreves for ekstrudering mye høyere, noe som ofte påvirker den innkapslede cellens levedyktighetnegativt 31,32. Suspensjonsbioprinting fjerner denne begrensningen, da det ekstruderte materialet støttes av opphengsbadet gjennom tverrbinding. Denne utviklingen øker enormt utvalget av bioblekkformuleringer som kan brukes. For eksempel har nyere arbeid vist bruken av kollagenløsninger med lav konsentrasjon som skrives ut i svært komplekse geometrier analoge med hjertets indre struktur33,34,35. I applikasjonene nevnt i denne metoden tillot innebygd utskrift at biomaterialblekk ble valgt for å best replikere det fysiologiske miljøet de var ment for, i stedet for deres evne til å bli skrevet ut.
Begrensninger i strukturstørrelse
Gjennom biofabrikasjonslitteraturen har det blitt demonstrert at forskjellige typer bioprintere, drevet av alternative skrivehodeteknologier, kan innlemmes i innebygde produksjonsteknikker. Teknologien som demonstreres her er ikke annerledes, med eksempler som inkluderer en pneumatisk mikroekstruderingsbasert bioprinter (INKREDIBLE), som demonstrert av Senior et al., og ekstruderingsbaserte bioprintere med kontrollerbare mikroventiler (3D Discovery)23. Selv om dette gjør teknologien tilgjengelig for en rekke brukere som kanskje allerede eier en bioprinter, er begrensninger på den oppnåelige størrelsen på strukturen til syvende og sist avhengig av de aktuelle bioprinterspesifikasjonene. I utgangspunktet er hovedbegrensningen på generering av store strukturer definert av størrelsen på utskriftssengen, grensene for X-, Y- og Z-baner, og også størrelsen på fartøyet der støttevæskegelen er inneholdt.
Begrensninger i oppløsning
Ved fremstilling av intrikate strukturer i mikrometerstørrelse er den resulterende oppløsningen svært avhengig av skriverens presisjon (kontroll over trinnstørrelse, ekstruderingsgrad), den indre diameteren på utskriftsdysen og en rekke justerbare programvareparametere, inkludert utskriftshastighet, utskriftstrykk og strømningshastighet36. I tillegg synes kontroll over dråpestørrelsen å være avgjørende for å lette genereringen av høyoppløselige strukturer, med de beste resultatene observert i ekstruderingsskrivere med en kontrollerbar mikroventil. Til slutt, når alle parametere er optimalisert, kan utskriftsoppløsninger oppnås for å matche, eller til og med være mindre enn, den indre diameteren av ekstruderingsdyser, med det avsatte filamentet i størrelsesordenmikrometerskalaen 37. Dette er imidlertid avhengig av optimalisering av alle utskriftsparametrene som tidligere er nevnt, og oppløsningen kan begrenses betydelig av utskriftsmekanismen og presisjonen. Pneumatisk ekstrudering ser for eksempel ikke ut til å tillate samme utskriftsoppløsning som ekstrudering med en kontrollerbar mikroklaff. Det er derfor en potensiell kostnadsimplikasjon for å oppnå maksimal utskriftsoppløsning, da slike systemer medfører en betydelig økt kostnad for brukeren.
Fremtidsutsikter og potensial
For øyeblikket er det stor interesse rundt bruken av suspenderte produksjonsprosesser for å tillate produksjon av komplekse myke strukturer som inneholder innebygde celler, og det vil utvilsomt være betydelige fremskritt i de kommende årene. Kontinuerlig fremgang i å forbedre utskriftsoppløsningen er gitt, selv om det gjenstår å se hvor nødvendig dette vil være, gitt at flertallet av biologiske systemer er i stand til å omorganisere seg på molekylært nivå. Mens fokuset av interesse i media er rundt bruken av 3D-printede vev for direkte å erstatte menneskelig vev etter skade eller sykdom, er eventuelle robuste medisinske prosedyrer aktivert av disse prosessene noen år unna38,39. Det er mer sannsynlig at virkningen av disse komplekse kultursystemene vil være i screening av legemidler eller til og med brukt som verktøy for å forbedre vår forståelse av biologiske prosesser38. Spesielt kan utviklingsbiologi ha stor nytte her, hvor presis kontroll over den spesielle avsetningen av molekyler vil tillate forskere å utforske rollen som multifaktorielle systemer på vevsutviklingsprosesser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker EPSRC (EP/L016346/1), MRC og Doctoral Training Alliance Biosciences for Health for finansiering og støtte til dette arbeidet.
3D Discovery Bioprinter | RegenHU | BIOFACTORY | Microvalve extrusion bioprinter |
Agarose | Merck | 9012-36-6 | Material used to create fluid gel support baths |
Benchtop autoclave | Prestige Medical | B8L75814 | Classic |
Brilliant Blue G | Merck | 6104-58-1 | Dye used to stain structures |
Calcium Chloride Dihydrate | Merck | 10035-04-8 | Used to reticulate printed structures |
Dexamethasone | Merck | D4902-25MG | Used in adipogenic media |
DMEM | Merck | D6429 | Cell culture media |
Duran bottle | Merck | Z305219 | glass bottle |
EVOS XL Core Imaging System | EVOS™ | AMEX1000 | Brightfield microscope with phase contrast |
FBS | Fisher Scientific | 10500-064 | Cell culture media supplement |
Gellan gum | Special Ingredients | 5060341112638 | Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model |
HEPES buffer | Merck | H9897-10PAK | Buffer for cell culture media |
Indomethacin | Merck | I7378 | Used in adipogenic media |
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) | Merck | I7018-100MG | Used in adipogenic media |
Keratinocyte growth medium | Lonza | 00192060 | Used as media to culture keratinocytes |
Low Methoxy Pectin | CP Kelco | LM-5CS | Pectin used to make pectin/collagen blends |
Penicillin-streptomycin | Merck | P4333-100ML | Used to inhibit bacterial growth |
PureCol EZ Gel solution | Merck | 5074 | Collagen solution used to make alginate/collagen blends |
Sodium Alginate | Merck | 9005-38-3 | Alginate powder used to make alginate/collagen blends |
TrypLE select | Fisher Scientific | 12563011 | cell dissociation enzyme |
T75 Flasks | StarLab | CC7682-4175 | Used for culturing cells |