羊膜からのルミカン抽出とその保管温度の決定
Summary
本プロトコルでは、羊膜(AM)からのルミカンの抽出とその保存条件をAM抽出物(AME)として-20°C、4°C、室温(RT)で6、12、20、および32日間行い、そのタンパク質とルミカン濃度を定量します。
Abstract
ルミカンは、ヒト羊膜(AM)にある小さなロイシンに富むプロテオグリカンで、角膜上皮化とコラーゲン線維の組織化を促進し、角膜の透明性を維持します。本研究では、AMからタンパク質を抽出してルミカンを得る方法が提案されている。さらに、異なる温度および期間で保存されたAM抽出物(AME)中のルミカンの安定性が評価される。100mgのAMを解凍し、機械的に脱上皮化した。脱上皮化したAMを凍結し、微粉末が得られるまで粉砕し、プロテアーゼ阻害剤を含む2.5 mLの生理食塩水で可溶化し、遠心分離してタンパク質抽出しました。上清を回収し、-20°C、4°C、室温(RT)で6、12、20、32日間保存した。その後、各AMEにおいてルミカンを定量化した。この技術により、AMからのルミカン抽出のためのアクセス可能で取得可能なプロトコルが可能になります。ルミカン濃度は保存時間および温度条件に影響された。-20°Cおよび4°Cで12日間保存されたAMEにおけるルミカンは、他のAMEよりも有意に高かった。このルミカン抽出は、治療法や医薬品溶液の開発に役立つ可能性があります。再上皮化および創傷治癒プロセスにおけるAMEルミカンの使用を決定するには、さらなる研究が必要です。
Introduction
角膜の愛情に最もよく使用される治療法の1つは羊膜移植です。しかし、近年、羊膜組織の様々な成分を代替治療および補助治療として使用するための新しい提案が浮上している。AMの最も研究されている成分の中には、AM抽出物(AME)1,2,3,4,5,6,7から得られるものがあります。AMには、抗血管新生タンパク質、インターロイキン(IL)、メタロプロテイナーゼの組織阻害剤(TIMP)、好中球細胞外トラップを阻害するTSG-6を媒介する抗炎症タンパク質、成長因子:上皮成長因子(EGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)(アルファおよびベータ)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、およびコラーゲン原線維形成を調節することによって角膜の透明性を維持するルミカンなどの複数の可溶性因子が含まれています1、 2,3,4,5,6,7,8,9。
ルミカンは、角膜間質マトリックスの間質性コラゲナーゼの主要な細胞外成分の1つである小さなロイシンリッチプロテオグリカン(SLRP)であり、コラーゲン線維の組織化と角膜の透明性の維持に関与しています4,10,11。プロテオグリカンは細胞外マトリックス(ECM)の分子であり、細胞シグナル伝達を実行し、細胞内の恒常性を維持する上で主要な分子です12。ECMタンパク質は、創傷治癒中の増殖、分化、および遊走の細胞プロセスを促進することが報告されています11。
証拠は、角膜再上皮化の過程におけるルミカンの参加の可能性を示している。Saikaらは、ある研究で、角膜損傷後、ルミカンが損傷後最初の8時間から最大3日の間に角膜角化細胞で検出できることを示しました。2日目と3日目に最高濃度のルミカンを示し、このプロテオグリカンはその後7日目には検出されなくなります13。これらのデータは、角膜再上皮化プロセスの活性化におけるルミカンの関与を示唆している。一方、別の研究では、ルミカンの欠如が再上皮化を遅らせることが報告されました。興味深いことに、ルミカンを追加すると、再上皮化プロセスが加速する可能性があります4,11,13。同様に、最近の研究では、ルミカンが角膜辺縁線維芽細胞の炎症機能を調節できることが報告されており14、これは、炎症、抗線維化および再上皮化応答のモジュレーターとしてのルミカンの役割を示唆している。同様に、ルミカンは、Fas-FasLなどのシグナル伝達分子と相互作用することによって角膜応答を調節することができる。また、ノックアウトLum–/-マウスモデルにルミカンが存在しないことは、ルミカンシグナル伝達の欠如が適切な角膜修復を妨げることを示した15。
主に、この方法は、AMからルミカンを抽出するための実行可能で親しみやすい方法を実証することを目的としています。この有利なルミカン抽出方法では、同様の濃度のタンパク質を得ることができ、処理時間が短縮され、以前の研究と比較して研究者にとってより便利になります16。さらに、このAMEルミカンは、角膜修復および再上皮化プロセスのアジュバントとして使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、ルミカンの存在がAMEで分析され、さまざまな保管条件下での安定性との直接的な相関関係が分析されました。興味深いことに、AME中の総タンパク質濃度を定量すると、保存後にタンパク質濃度が増加した。証拠は、凍結貯蔵中のタンパク質濃度を変化させる可能性のある3つのメカニズムを示唆しています:低温変性、溶質の凍結濃度、およびタンパク質構造の氷誘発部分的な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は競合する金銭的利益を持っていません。
Materials
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
References
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