يصف البروتوكول الحالي استخراج اللوميكان من الغشاء الأمنيوسي (AM) وظروف تخزينه كمستخلص AM (AME) عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما لتحديد بروتيناته وتركيز اللوميكان.
Lumican هو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين في الغشاء الأمنيوسي البشري (AM) الذي يعزز ظهارة القرنية وتنظيم ألياف الكولاجين ، والحفاظ على شفافية القرنية. في العمل الحالي ، تم اقتراح طريقة لاستخراج البروتين من AM للحصول على lumican. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقييم استقرار lumican في مستخلص AM (AME) المخزن في درجات حرارة وفترات زمنية مختلفة. تم إذابة 100 ملغ من AM وإزالة الظهارة الميكانيكية. تم تجميد AM المنزوع الظهارة وسحقه حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم ، والذي تم إذابته ب 2.5 مل من المحلول الملحي مع مثبطات الأنزيم البروتيني والطرد المركزي لاستخراج البروتين. تم جمع المادة الطافية وتخزينها في -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 6 و 12 و 20 و 32 يوما. بعد ذلك ، تم تحديد كمية lumican في كل AME. تسمح هذه التقنية ببروتوكول يمكن الوصول إليه واكتسابه لاستخراج اللوميكان من AM. تأثر تركيز اللوميكان بوقت التخزين وظروف درجة الحرارة. كان Lumican في AME لمدة 12 يوما مخزنا عند -20 درجة مئوية و 4 درجات مئوية أعلى بكثير من AME الأخرى. يمكن أن يكون استخراج اللوميكان هذا مفيدا لتطوير العلاجات والحلول الصيدلانية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد استخدامات AME lumican في عملية إعادة الاندمال وشفاء الجروح.
واحدة من العلاجات الأكثر استخداما لأمراض القرنية هو زرع الغشاء الأمنيوسي. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقترحات جديدة لاستخدام مكونات مختلفة من الأنسجة الأمنيوسية كعلاجات بديلة ومساعدة. من بين المكونات الأكثر دراسة من AM هي تلك التي تم الحصول عليها من استخراج AM (AME)1،2،3،4،5،6،7. يحتوي AM على العديد من العوامل القابلة للذوبان مثل البروتينات المضادة لتولد الأوعية ، والإنترلوكينات (IL) ، ومثبطات الأنسجة للبروتينات المعدنية (TIMPs) ، والبروتينات المضادة للالتهابات بوساطة TSG-6 التي تمنع مصائد العدلات خارج الخلية ، وعوامل النمو: عامل نمو البشرة (EGF) ، عامل النمو المحول (TGF) (ألفا وبيتا) ، عامل نمو الخلايا الكيراتينية (KGF) ، عامل نمو خلايا الكبد (HGF) ، ولوميكان ، الذي يحافظ على شفافية القرنية من خلال تنظيم تكوين ألياف الكولاجين1 ، 2،3،4،5،6،7،8،9.
Lumican هو بروتيوغليكان صغير غني بالليوسين (SLRP) ، وهو أحد المكونات الرئيسية خارج الخلية للكولاجيناز الخلالي في مصفوفة سدى القرنية ، وهو مسؤول عن تنظيم ألياف الكولاجين والحفاظ على شفافية القرنية4،10،11. البروتيوغليكان هي جزيئات في المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وهي الجزيئات الرئيسية في تنفيذ إشارات الخلية والحفاظ على التوازن داخل الخلايا12. تم الإبلاغ عن بروتينات ECM لدفع العمليات الخلوية للانتشار والتمايز والهجرة أثناء التئام الجروح11.
تشير الأدلة إلى احتمال مشاركة اللوميكان في عملية إعادة الظهارة القرنية. أظهر Saika et al. ، في دراسة ، أنه بعد إصابة القرنية ، يمكن اكتشاف lumican في خلايا القرنية القرنية بين أول 8 ساعات وحتى 3 أيام بعد الإصابة. تقديم أعلى تركيز من lumican في اليوم الثاني والثالث ، وهذا البروتيوغليكان لا يمكن اكتشافه في اليوم السابع13. تشير هذه البيانات إلى مشاركة اللوميكان في تنشيط عملية إعادة الاندمال الظهاري للقرنية. من ناحية أخرى ، في دراسة أخرى ، أفيد أن عدم وجود lumican يؤخر إعادة الاندمال الظهاري. ومن المثير للاهتمام ، أن إضافة Lumican يمكن أن يسرع عملية إعادة الاندمال الظهاري4،11،13. وبالمثل ، أفادت دراسة حديثة أن اللوميكان يمكن أن يعدل الوظائف الالتهابية للخلايا الليفية القرنية14 ، مما يشير إلى دور اللوميكان كمغير للاستجابة الالتهابية والمضادة للتليف وإعادة الاندمال. وبالمثل ، يمكن لوميكان تعديل استجابة القرنية من خلال التفاعل مع جزيئات الإشارة مثل Fas-FasL. أيضا ، أظهر غياب lumican في نموذج Lum–/- mouse بالضربة القاضية أن عدم وجود إشارات lumican يمنع إصلاح القرنية الكافي15.
في المقام الأول ، تهدف هذه الطريقة إلى إظهار طريقة مجدية وسهلة لاستخراج اللوميكان من AM. باستخدام هذه الطريقة المفيدة لاستخراج اللوميكان ، من الممكن الحصول على تركيزات مماثلة من البروتينات ، مما يقلل من وقت المعالجة ويجعلها أكثر ملاءمة للمحققين مقارنة بالدراسات السابقة16. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام AME lumican كمساعد لإصلاح القرنية وعمليات إعادة الاندمال الظهاري.
في هذه الدراسة ، تم تحليل وجود lumican في AME وعلاقته المباشرة مع ثباته في ظل ظروف التخزين المختلفة. ومن المثير للاهتمام ، عندما تم تحديد تركيز البروتين الكلي في AME ، زاد تركيز البروتين بعد التخزين. تشير الدلائل إلى ثلاث آليات يمكن أن تغير تركيز البروتين في التخزين المجمد: التمسخ البارد ، والترك?…
The authors have nothing to disclose.
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.
1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
100 μL micropipette | Eppendorf | ||
1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
20 μL micropipette | Eppendorf | ||
20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
Aluminum foil | N/A | N/A | |
Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
Beaker | N/A | N/A | |
BioRender | BioRender | figures design | |
Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
Freezer | |||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
Mortar | N/A | N/A | |
Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
Paper towels | N/A | N/A | |
Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
Ultrapure water | PISA | ||
Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |