Modellierung der menschlichen Kleinhirnentwicklung in vitro in 2D-Struktur
Summary
Das vorliegende Protokoll erklärt die Erzeugung einer 2D-Monoschicht von Kleinhirnzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Untersuchung der frühen Stadien der Kleinhirnentwicklung.
Abstract
Die präzise und rechtzeitige Entwicklung des Kleinhirns ist nicht nur für eine genaue motorische Koordination und Balance, sondern auch für die Kognition von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus wurde eine Störung der Kleinhirnentwicklung mit vielen neurologischen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht, darunter Autismus, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und Schizophrenie. Untersuchungen der Kleinhirnentwicklung beim Menschen waren bisher nur durch Post-mortem-Studien oder Neuroimaging möglich, doch reichen diese Methoden nicht aus, um die molekularen und zellulären Veränderungen in vivo während der frühen Entwicklung zu verstehen, wenn viele neurologische Entwicklungsstörungen entstehen. Das Aufkommen von Techniken zur Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus somatischen Zellen und die Fähigkeit, iPS-Zellen weiter in Neuronen umzudifferenzieren, haben den Weg für die In-vitro-Modellierung der frühen Gehirnentwicklung geebnet. Die vorliegende Studie bietet vereinfachte Schritte zur Erzeugung von Kleinhirnzellen für Anwendungen, die eine 2-dimensionale (2D) Monoschichtstruktur erfordern. Kleinhirnzellen, die frühe Entwicklungsstadien repräsentieren, werden aus menschlichen iPS-Zellen über die folgenden Schritte abgeleitet: Zuerst werden embryoide Körper in 3-dimensionaler (3D) Kultur hergestellt, dann werden sie mit FGF2 und Insulin behandelt, um die Spezifikation des Kleinhirnschicksals zu fördern, und schließlich werden sie terminalerweise als Monoschicht auf Poly-L-Ornithin (PLO) / Laminin-beschichteten Substraten differenziert. Nach 35 Tagen Differenzierung exprimieren iPSC-abgeleitete Kleinhirnzellkulturen Kleinhirnmarker wie ATOH1, PTF1α, PAX6 und KIRREL2, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll glutamaterge und GABAerge zerebelläre neuronale Vorläufer sowie Purkinje-Zellvorläufer erzeugt. Darüber hinaus zeigen die differenzierten Zellen eine ausgeprägte neuronale Morphologie und sind positiv für Immunfluoreszenzmarker der neuronalen Identität wie TUBB3. Diese Zellen exprimieren axonale Leitmoleküle, einschließlich Semaphorin-4C, Plexin-B2 und Neuropilin-1, und könnten als Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen des Neuritenwachstums und der synaptischen Konnektivität dienen. Diese Methode erzeugt menschliche Kleinhirnneuronen, die für nachgelagerte Anwendungen nützlich sind, einschließlich Genexpression, physiologischer und morphologischer Studien, die 2D-Monoschichtformate erfordern.
Introduction
Das Verständnis der menschlichen Kleinhirnentwicklung und der kritischen Zeitfenster dieses Prozesses ist nicht nur wichtig, um die möglichen Ursachen neurologischer Entwicklungsstörungen zu entschlüsseln, sondern auch um neue Ziele für therapeutische Interventionen zu identifizieren. Die Modellierung der menschlichen Kleinhirnentwicklung in vitro war eine Herausforderung, doch im Laufe der Zeit sind viele Protokolle zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) oder iPS-Zellen mit Kleinhirnlinienschicksalen entstanden 1,2,3,4,5,6,7,8 . Darüber hinaus ist es wichtig, Protokolle zu entwickeln, die reproduzierbare Ergebnisse liefern, relativ einfach sind (um Fehler zu reduzieren) und keine hohen monetären Kosten verursachen.
Die ersten Protokolle für die Kleinhirndifferenzierung wurden aus 2D-Kulturen aus plattierten embryoiden Körpern (EBs) generiert, die das Kleinhirnschicksal mit verschiedenen Wachstumsfaktoren ähnlich der In-vivo-Entwicklung induzierten, einschließlich WNT, BMPs und FGFs 1,9. Neuere veröffentlichte Protokolle induzierten eine Differenzierung hauptsächlich in der 3D-Organoidkultur mit FGF2 und Insulin, gefolgt von FGF19 und SDF1 für rhombische lippenartige Strukturen3,4 oder verwendeten eine Kombination aus FGF2, FGF4 und FGF85. Beide Kleinhirn-Organoid-Induktionsmethoden führten zu ähnlichen 3D-Kleinhirn-Organoiden, da beide Protokolle eine ähnliche Kleinhirnmarkerexpression zu identischen Zeitpunkten berichteten. Holmes und Heine erweiterten ihr 3D-Protokoll5, um zu zeigen, dass 2D-Kleinhirnzellen aus hES-Zellen und iPS-Zellen erzeugt werden können, die als 3D-Aggregate beginnen. Darüber hinaus zeigten Silva et al.7, dass Zellen, die reife Kleinhirnneuronen in 2D repräsentieren, mit einem ähnlichen Ansatz wie Holmes und Heine erzeugt werden können, wobei ein anderer Zeitpunkt für den Wechsel von 3D zu 2D verwendet wird und die Wachstums- und Reifezeit verlängert wird.
Das aktuelle Protokoll induziert das Kleinhirnschicksal in feederfreien iPS-Zellen, indem es frei schwebende embryoide Körper (EBs) mit Insulin und FGF2 erzeugt und dann die EBs am Tag 14 auf PLO / Laminin-beschichtetem Geschirr für 2D-Wachstum und Differenzierung plattiert. Am Tag 35 werden Zellen mit Kleinhirnidentität erhalten. Die Fähigkeit, die frühen Stadien der Kleinhirnentwicklung, insbesondere in einer 2D-Umgebung, zu rekapitulieren, ermöglicht es Forschern, spezifische Fragen zu beantworten, die Experimente mit einer Monoschichtstruktur erfordern. Dieses Protokoll ist auch für weitere Modifikationen wie mikrostrukturierte Oberflächen, axonale Auswuchsassays und Zellsortierung zugänglich, um die gewünschten Zellpopulationen anzureichern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fähigkeit, die menschliche Kleinhirnentwicklung in vitro zu modellieren, ist wichtig für die Krankheitsmodellierung sowie für das Verständnis der normalen Gehirnentwicklung. Weniger komplizierte und kostengünstige Protokolle schaffen mehr Möglichkeiten für replizierbare Datengenerierung und breite Implementierung in mehreren wissenschaftlichen Labors. Ein Kleinhirndifferenzierungsprotokoll wird hier unter Verwendung einer modifizierten Methode zur Erzeugung von EBs beschrieben, die keine Enzyme oder D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Jenny Gringer Richards für ihre gründliche Arbeit bei der Validierung unserer Kontrollpersonen, aus der wir die Kontroll-iPSCs generiert haben. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH T32 MH019113 (an D.A.M. und K.A.K.), dem Nellie Ball Trust (an T.H.W. und A.J.W.), NIH R01 MH111578 (an V.A.M. und J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (an A.J.W.) und dem Roy J. Carver Charitable Trust (an V.A.M., J.A.W. und A.J.W.). Die Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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