2 डी संरचना में विट्रो में मानव अनुमस्तिष्क विकास मॉडलिंग
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल अनुमस्तिष्क विकास के शुरुआती चरणों की जांच के लिए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से अनुमस्तिष्क कोशिकाओं के 2 डी मोनोलेयर की पीढ़ी की व्याख्या करता है।
Abstract
सेरिबैलम का सटीक और समय पर विकास न केवल सटीक मोटर समन्वय और संतुलन के लिए बल्कि अनुभूति के लिए भी महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अनुमस्तिष्क विकास में व्यवधान को ऑटिज़्म, ध्यान घाटे-अति सक्रियता विकार (एडीएचडी), और सिज़ोफ्रेनिया सहित कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों में फंसाया गया है। मनुष्यों में अनुमस्तिष्क विकास की जांच पहले केवल पोस्टमार्टम अध्ययन या न्यूरोइमेजिंग के माध्यम से संभव हुई है, फिर भी ये विधियां प्रारंभिक विकास के दौरान विवो में होने वाले आणविक और सेलुलर परिवर्तनों को समझने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, जब कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकार उत्पन्न होते हैं। दैहिक कोशिकाओं से मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) उत्पन्न करने की तकनीकों के उद्भव और न्यूरॉन्स में आईपीएससी को फिर से अलग करने की क्षमता ने प्रारंभिक मस्तिष्क विकास के इन विट्रो मॉडलिंग का मार्ग प्रशस्त किया है। वर्तमान अध्ययन उन अनुप्रयोगों के लिए अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को उत्पन्न करने की दिशा में सरलीकृत कदम प्रदान करता है जिनके लिए 2-आयामी (2 डी) मोनोलेयर संरचना की आवश्यकता होती है। प्रारंभिक विकास चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाली अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को निम्नलिखित चरणों के माध्यम से मानव आईपीएससी से प्राप्त किया जाता है: सबसे पहले, भ्रूण निकायों को 3-आयामी (3 डी) संस्कृति में बनाया जाता है, फिर उन्हें अनुमस्तिष्क भाग्य विनिर्देश को बढ़ावा देने के लिए एफजीएफ 2 और इंसुलिन के साथ इलाज किया जाता है, और अंत में, उन्हें पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ)/लैमिनिन-लेपित सब्सट्रेट्स पर मोनोलेयर के रूप में अंतिम रूप से विभेदित किया जाता है। भेदभाव के 35 दिनों में, आईपीएससी-व्युत्पन्न अनुमस्तिष्क सेल संस्कृतियां एटीओएच 1, पीटीएफ 1, पैक्स 6 और किर्रेल 2 सहित अनुमस्तिष्क मार्करों को व्यक्त करती हैं, यह सुझाव देते हुए कि यह प्रोटोकॉल ग्लूटामेटर्जिक और जीएबीएर्जिक अनुमस्तिष्क न्यूरोनल अग्रदूतों के साथ-साथ पर्किन्जे सेल पूर्वजों को उत्पन्न करता है। इसके अलावा, विभेदित कोशिकाएं अलग-अलग न्यूरोनल आकृति विज्ञान दिखाती हैं और न्यूरोनल पहचान के इम्यूनोफ्लोरेसेंस मार्करों जैसे टीयूबीबी 3 के लिए सकारात्मक होती हैं। ये कोशिकाएं सेमाफोरिन -4 सी, प्लेक्सिन-बी 2 और न्यूरोपिलिन -1 सहित अक्षीय मार्गदर्शन अणुओं को व्यक्त करती हैं, और न्यूराइट आउटग्रोथ और सिनैप्टिक कनेक्टिविटी के आणविक तंत्र की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकती हैं। यह विधि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी मानव अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स उत्पन्न करती है, जिसमें जीन अभिव्यक्ति, शारीरिक और रूपात्मक अध्ययन शामिल हैं जिनके लिए 2 डी मोनोलेयर प्रारूपों की आवश्यकता होती है।
Introduction
मानव अनुमस्तिष्क विकास और इस प्रक्रिया की महत्वपूर्ण समय खिड़कियों को समझना न केवल न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों के संभावित कारणों को डिकोड करने के लिए बल्कि चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए नए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। विट्रो में मानव अनुमस्तिष्क विकास का मॉडलिंग चुनौतीपूर्ण रहा है, फिर भी समय के साथ, अनुमस्तिष्क वंश भाग्य के साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) या आईपीएससी को अलग करने वाले कई प्रोटोकॉल उभरे हैं 1,2,3,4,5,6,7,8 . इसके अलावा, प्रोटोकॉल विकसित करना महत्वपूर्ण है जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करते हैं, अपेक्षाकृत सरल हैं (त्रुटि को कम करने के लिए), और मौद्रिक लागत पर भारी नहीं हैं।
अनुमस्तिष्क विभेदन के लिए पहले प्रोटोकॉल प्लेटेड भ्रूण निकायों (ईबी) से 2 डी संस्कृतियों से उत्पन्न हुए थे, जो विवो विकास के समान विभिन्न विकास कारकों के साथ अनुमस्तिष्क भाग्य को प्रेरित करते थे, जिसमें डब्ल्यूएनटी, बीएमपी और एफजीएफ 1,9 शामिल थे। हाल ही में प्रकाशित प्रोटोकॉल ने मुख्य रूप से एफजीएफ 2 और इंसुलिन के साथ 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृति में भेदभाव को प्रेरित किया, इसके बाद एफजीएफ 19 और एसडीएफ 1 के लिए रोडम्बिक होंठ जैसी संरचनाओं 3,4, या एफजीएफ 2, एफजीएफ 4 और एफजीएफ 85 के संयोजन का उपयोग किया। दोनों अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोइड प्रेरण विधियों के परिणामस्वरूप समान 3 डी अनुमस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स थे क्योंकि दोनों प्रोटोकॉल ने समान समय बिंदुओं पर समान अनुमस्तिष्क मार्कर अभिव्यक्ति की सूचना दी थी। होम्स और हेन ने अपने 3 डी प्रोटोकॉल5 को यह दिखाने के लिए विस्तारित किया कि 2 डी अनुमस्तिष्क कोशिकाओं को एचईएससी और आईपीएससी से उत्पन्न किया जा सकता है, जो 3 डी समुच्चय के रूप में शुरू होते हैं। इसके अलावा, सिल्वा एट अल.7 ने प्रदर्शित किया कि 2 डी में परिपक्व अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करने वाली कोशिकाओं को होम्स और हेन के समान दृष्टिकोण के साथ उत्पन्न किया जा सकता है, 3 डी से 2 डी तक स्विच करने और विकास और परिपक्वता के समय का विस्तार करने के लिए एक अलग समय बिंदु का उपयोग करके।
वर्तमान प्रोटोकॉल इंसुलिन और एफजीएफ 2 का उपयोग करके मुक्त-फ्लोटिंग भ्रूण निकायों (ईबी) का उत्पादन करके फीडर-मुक्त आईपीएससी में अनुमस्तिष्क भाग्य को प्रेरित करता है और फिर 2 डी विकास और भेदभाव के लिए 14 वें दिन पीएलओ / लैमिनिन-लेपित व्यंजनों पर ईबी चढ़ाता है। दिन 35 तक, अनुमस्तिष्क पहचान वाली कोशिकाएं प्राप्त की जाती हैं। अनुमस्तिष्क विकास के शुरुआती चरणों को पुन: उत्पन्न करने की क्षमता, विशेष रूप से 2 डी वातावरण में, शोधकर्ताओं को मोनोलेयर संरचना के साथ प्रयोगों की आवश्यकता वाले विशिष्ट प्रश्नों का उत्तर देने की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल वांछित सेल आबादी को समृद्ध करने के लिए माइक्रोपैटर्न सतहों, अक्षीय आउटग्रोथ परख और सेल सॉर्टिंग जैसे आगे के संशोधनों के लिए भी उत्तरदायी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विट्रो में मानव अनुमस्तिष्क विकास को मॉडल करने की क्षमता रोग मॉडलिंग के साथ-साथ सामान्य मस्तिष्क के विकास की समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है। कम जटिल और लागत प्रभावी प्रोटोकॉल कई वैज्ञानिक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जेनी ग्रिंगर रिचर्ड्स को हमारे नियंत्रण विषयों को मान्य करने में उनके गहन काम के लिए धन्यवाद देते हैं, जिससे हमने नियंत्रण आईपीएससी उत्पन्न किया। इस काम को एनआईएच टी 32 एमएच 019113 (डीएएम और केएके), नेल्ली बॉल ट्रस्ट (टीएचडब्ल्यू और एजेडब्ल्यू), एनआईएच आर 01 एमएच 111578 (वीएएम और जेएडब्ल्यू के लिए), एनआईएच केएल 2 टीआर 002536 (एजेडब्ल्यू के लिए), और रॉय जे कार्वर चैरिटेबल ट्रस्ट (जेडब्ल्यू के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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