Modellering av mänsklig cerebellär utveckling in vitro i 2D-struktur
Summary
Detta protokoll förklarar genereringen av ett 2D-monolager av cerebellära celler från inducerade pluripotenta stamceller för att undersöka de tidiga stadierna av cerebellär utveckling.
Abstract
Den exakta och snabba utvecklingen av lillhjärnan är avgörande inte bara för exakt motorisk koordination och balans utan också för kognition. Dessutom har störningar i cerebellär utveckling varit inblandade i många neurodevelopmental störningar, inklusive autism, attention deficit-hyperactivity disorder (ADHD) och schizofreni. Undersökningar av cerebellär utveckling hos människor har tidigare endast varit möjliga genom obduktionsstudier eller neuroimaging, men dessa metoder är inte tillräckliga för att förstå de molekylära och cellulära förändringar som sker in vivo under tidig utveckling, vilket är när många neuroutvecklingsstörningar uppträder. Framväxten av tekniker för att generera humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) från somatiska celler och förmågan att ytterligare omdifferentiera iPSC till nervceller har banat väg för in vitro-modellering av tidig hjärnutveckling. Denna studie ger förenklade steg mot att generera cerebellära celler för applikationer som kräver en 2-dimensionell (2D) monolagerstruktur. Cerebellära celler som representerar tidiga utvecklingsstadier härrör från humana iPSC via följande steg: först tillverkas embryoidkroppar i 3-dimensionell (3D) kultur, sedan behandlas de med FGF2 och insulin för att främja cerebellär ödespecifikation, och slutligen differentieras de terminalt som ett monolager på poly-l-ornitin (PLO) / lamininbelagda substrat. Vid 35 dagars differentiering uttrycker iPSC-härledda cerebellära cellkulturer cerebellära markörer inklusive ATOH1, PTF1α, PAX6 och KIRREL2, vilket tyder på att detta protokoll genererar glutamaterga och GABAerga cerebellära neuronala prekursorer, liksom Purkinje-cellförfäder. Dessutom visar de differentierade cellerna distinkt neuronal morfologi och är positiva för immunofluorescensmarkörer för neuronal identitet såsom TUBB3. Dessa celler uttrycker axonala vägledningsmolekyler, inklusive semaphorin-4C, plexin-B2 och neuropilin-1, och kan fungera som en modell för att undersöka de molekylära mekanismerna för neuritutväxt och synaptisk anslutning. Denna metod genererar mänskliga cerebellära neuroner som är användbara för nedströmsapplikationer, inklusive genuttryck, fysiologiska och morfologiska studier som kräver 2D-monolagerformat.
Introduction
Att förstå mänsklig cerebellär utveckling och de kritiska tidsfönstren i denna process är viktigt inte bara för att avkoda de möjliga orsakerna till neurodevelopmental störningar utan också för att identifiera nya mål för terapeutisk intervention. Modellering av mänsklig cerebellär utveckling in vitro har varit utmanande, men med tiden har många protokoll som skiljer mänskliga embryonala stamceller (hESC) eller iPSC med cerebellär härstamning öden uppstått 1,2,3,4,5,6,7,8 . Dessutom är det viktigt att utveckla protokoll som genererar reproducerbara resultat, är relativt enkla (för att minska fel) och inte är tunga på monetära kostnader.
De första protokollen för cerebellär differentiering genererades från 2D-kulturer från pläterade embryoidkroppar (EBs), vilket inducerade cerebellärt öde med olika tillväxtfaktorer som liknar in vivo-utveckling, inklusive WNT, BMP och FGF 1,9. Nyare publicerade protokoll inducerade differentiering främst i 3D-organoidkultur med FGF2 och insulin, följt av FGF19 och SDF1 för rombiska läppliknande strukturer3,4, eller använde en kombination av FGF2, FGF4 och FGF85. Båda cerebellära organoidinduktionsmetoderna resulterade i liknande 3D-cerebellära organoider eftersom båda protokollen rapporterade liknande cerebellärt marköruttryck vid identiska tidpunkter. Holmes och Heine utökade sitt 3D-protokoll5 för att visa att 2D-cerebellära celler kan genereras från hESC och iPSC, som börjar som 3D-aggregat. Dessutom visade Silva et al.7 att celler som representerar mogna cerebellära neuroner i 2D kan genereras med ett liknande tillvägagångssätt som Holmes och Heine, med hjälp av en annan tidpunkt för att byta från 3D till 2D och förlänga tiden för tillväxt och mognad.
Det nuvarande protokollet inducerar cerebellärt öde i matarfria iPSC genom att generera fritt flytande embryoidkroppar (EB) med insulin och FGF2 och sedan plätera EBs på PLO / lamininbelagda rätter på dag 14 för 2D-tillväxt och differentiering. Vid dag 35 erhålls celler med cerebellär identitet. Förmågan att rekapitulera de tidiga stadierna av cerebellär utveckling, särskilt i en 2D-miljö, gör det möjligt för forskare att svara på specifika frågor som kräver experiment med en monolagerstruktur. Detta protokoll är också mottagligt för ytterligare modifieringar såsom mikromönstrade ytor, axonala utväxtanalyser och cellsortering för att berika de önskade cellpopulationerna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Förmågan att modellera human cerebellär utveckling in vitro är viktig för sjukdomsmodellering samt för att främja förståelsen för normal hjärnutveckling. Mindre komplicerade och kostnadseffektiva protokoll skapar fler möjligheter för replikerbar datagenerering och bred implementering över flera vetenskapliga laboratorier. Ett cerebellärt differentieringsprotokoll beskrivs här med hjälp av en modifierad metod för att generera EBs som inte kräver enzymer eller dissociationsmedel, med hjälp av t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jenny Gringer Richards för hennes grundliga arbete med att validera våra kontrollpersoner, från vilka vi genererade kontroll-iPSC: erna. Detta arbete stöddes av NIH T32 MH019113 (till D.A.M. och K.A.K.), Nellie Ball Trust (till T.H.W. och A.J.W.), NIH R01 MH111578 (till V.A.M. och J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (till A.J.W.) och Roy J. Carver Charitable Trust (till V.A.M., J.A.W. och A.J.W.). Figurerna skapades med BioRender.com.
Materials
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90×250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
- Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
- Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
- Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
- Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
- Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. 발생학. 338 (2), 202-214 (2010).
- Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
- Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
- Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
- Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
- Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
- Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
- Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
- Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
- Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
- Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
- Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
- Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
- Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
- Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).
